唐 宋， 張曉南

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147)

根據(jù)《第四次中國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告》，我國(guó)成年人的牙周健康率僅約9.1%，且牙周炎患病率與年齡呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。生理情況下牙周膜血流比牙髓或腦血流稍低，其氧含量為2.9%～5.7%，且易受咬合力的影響[1]。牙周炎是低氧相關(guān)疾病之一，近年來，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)牙周組織發(fā)生病變時(shí)，因局部炎性因子釋放和組織代謝增強(qiáng)引起氧的供求失衡，以及炎癥環(huán)境引起血液微循環(huán)破壞，均可導(dǎo)致局部牙周組織處于相對(duì)缺血、低氧狀態(tài)，而深牙周袋和牙周致病菌可進(jìn)一步降低牙周組織的氧張力[1-2]。本綜述探討牙周組織低氧與牙周炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及炎性分子機(jī)制，為牙周炎的防治提供一定的臨床借鑒。

1 低氧與缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1， HIF-1)

缺氧環(huán)境下機(jī)體可通過多種生物學(xué)變化和生化反應(yīng)來提高細(xì)胞氧合及存活率[3]，包括促血管新生、改善細(xì)胞代謝以及調(diào)控細(xì)胞活性相關(guān)分子表達(dá)等。HIF是缺氧介導(dǎo)相關(guān)事件(包括炎癥、腫瘤等)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，主要包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，而在缺氧反應(yīng)中最重要的調(diào)節(jié)蛋白是異源二聚體HIF-1，對(duì)于HIF-2及HIF-3的研究還需要更進(jìn)一步地深入。

HIF-1是哺乳動(dòng)物缺氧反應(yīng)中最重要的響應(yīng)分子之一，它是由兩個(gè)亞單位組成的異二聚體： 一個(gè)α亞單位，與氧濃度呈負(fù)相關(guān)；一個(gè)β亞單位，與氧濃度無明顯相關(guān)[4]。HIF-1α和HIF-1β均包含兩種特殊結(jié)構(gòu)： 堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(basic helix-loop-helix)和PAS結(jié)構(gòu)域，其中這兩種結(jié)構(gòu)的羧基半端是HIF-1與DNA結(jié)合的位點(diǎn)?！叭毖鯌?yīng)答元件”(hypoxia response element， HRE)是一類特異性的DNA序列，通過與HIF-1結(jié)合而引起HIF-1相關(guān)靶基因表達(dá)的上調(diào)[4]。常氧條件下HIF-1α被脯氨酸羥化酶迅速降解，而低氧干擾脯氨酸羥化酶介導(dǎo)的HIF-1α降解，導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定化，并通過兩個(gè)核定位信號(hào)在低氧細(xì)胞的細(xì)胞核中積累，從而與HIF-1β形成異源二聚體，隨后激活HIF-1途徑，然而有研究表明HIF-1β并不是HIF-1α核內(nèi)積累的必要條件[5]，因此猜測(cè)HIF-1α可獨(dú)立于HIF-1β發(fā)揮功能，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。低氧是包括炎癥、腫瘤等在內(nèi)很多疾病的共同特征，牙周炎是近年來發(fā)現(xiàn)的低氧性疾病之一，揭示低氧與牙周炎的相互關(guān)系對(duì)牙周病防治意義重大。

2 低氧對(duì)牙周細(xì)胞增殖能力的影響

牙周細(xì)胞可參與牙周組織形成再生及免疫分泌功能，對(duì)牙周組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，但在牙周炎和正畸治療等過程中，牙周組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，牙周組織易發(fā)生缺氧性改變，明顯影響牙周細(xì)胞的正常增殖及遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)，低氧與牙周細(xì)胞增殖作用存有時(shí)間依賴性關(guān)系，且與不同氧濃度相關(guān)。在重度缺氧(1%O2)、中度缺氧(2%O2)和輕度缺氧(5%O2)條件下培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblast, hPLF)，發(fā)現(xiàn)其增殖率在初期(24 h)增加而后期(48、72 h)下降，且隨氧濃度的降低其增殖抑制的現(xiàn)象出現(xiàn)越早且越明顯，牙周膜細(xì)胞也有類似的表型[6-7]。但有研究稱短暫缺氧(1 h、2%O2)即可出現(xiàn)人牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)增殖活性下降[8]。觀察和培養(yǎng)的方式、缺氧條件的時(shí)間框架以及細(xì)胞類型的差異都可以導(dǎo)致這些特異性研究結(jié)果產(chǎn)生。在缺氧條件下，人牙周膜韌帶細(xì)胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)與細(xì)胞呼吸代謝密切相關(guān)的蛋白組學(xué)(包括LDHA、GAPDH等)發(fā)生顯著變化[6]，這些代謝變化為細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)提供了必需的能量，可部分解釋細(xì)胞增殖變化的原因。

嚴(yán)重炎癥和組織破壞的病變往往具有較低的成纖維細(xì)胞密度和較高的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周炎病變?cè)絿?yán)重，牙齦成纖維細(xì)胞的數(shù)量和功能也明顯降低，且成纖維細(xì)胞增殖分化和遷移能力隨著年齡的增長(zhǎng)而下降[9-10]。體外研究表明，在低氧培養(yǎng)環(huán)境中牙周膜韌帶細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的多種細(xì)胞功能(如增殖分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生等)發(fā)生改變[11]。低氧對(duì)牙周細(xì)胞增殖分化及遷移的影響是通過多種信號(hào)通路的激活而發(fā)生的，通過Wnt、Notch和Shh等信號(hào)途徑，HIF-1α在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和多能性方面發(fā)揮重要作用[12]。低氧可能通過調(diào)節(jié)牙周細(xì)胞的增殖分化及遷移促進(jìn)組織的修復(fù)再生，其機(jī)制研究是目前熱點(diǎn)，這可能為牙周組織的新生提供新的策略。

3 低氧對(duì)牙槽骨的影響

低氧對(duì)牙槽骨的影響一方面是由于多種牙周組織細(xì)胞(如hPDLCs、HGFs等)因低氧刺激而產(chǎn)生促炎介質(zhì)及細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、MMP、PGE2、NO和TNF-α等)，從而打破牙槽骨正常的代謝平衡，引起骨和膠原的代謝紊亂[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α升高后通過上調(diào)Smad泛素調(diào)節(jié)因子1(Smurf1)水平誘導(dǎo)骨丟失[14]，而牙周炎所致骨丟失的具體機(jī)制仍然需要深入研究。亦有研究發(fā)現(xiàn)，PDLCs的增殖和成骨分化因低氧而抑制[15]。更多研究表明低氧激活PDLSCs、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨分化[7，8，16]。由于細(xì)胞活力、種類及觀察培養(yǎng)方法的差異可能導(dǎo)致了低氧對(duì)牙周細(xì)胞成骨分化的影響呈現(xiàn)出不同的研究結(jié)果。

對(duì)低氧介導(dǎo)的骨代謝機(jī)制進(jìn)行研究是理解牙周炎所致牙槽骨丟失機(jī)制的重要途徑，研究發(fā)現(xiàn)多條骨代謝相關(guān)通路的激活與低氧相關(guān)。PDLSCs作為牙周組織修復(fù)再生的重要來源，低氧通過MEK/ERK和p38MAPK信號(hào)通路可促進(jìn)PDLSCs成骨分化，而MAPK及ERK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)成骨細(xì)胞分化、成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)和MSC向成骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化也起關(guān)鍵作用[7-8]，p38MAPK對(duì)缺氧的反應(yīng)比ERK更迅速，這說明p38MAPK在低氧誘導(dǎo)的PDLSCs成骨分化中可能發(fā)揮更重要的作用。另外，通過體外低氧模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hPDLCs中HIF-1α表達(dá)增多，隨后炎性介質(zhì)表達(dá)通過PI3k、p38、ERK、JNK、PKC和NF-κB途徑而上調(diào)[17]，從而影響骨和膠原代謝，這與低氧下牙周細(xì)胞中促炎介質(zhì)及細(xì)胞因子表達(dá)增加的趨勢(shì)一致。已有研究表明低氧環(huán)境下HIF-1途徑參與骨的形成和改建，而且認(rèn)為HIF-1α在成骨耦合與血管新生中起著重要的調(diào)控作用[18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因敲除小鼠的骨小梁體積和骨形成率明顯降低，其皮質(zhì)骨也發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞分化潛能被過表達(dá)HIF-1α活性形式所抑制[19-20]；Hirai等發(fā)現(xiàn)HIF-1的激活可下調(diào)NF-κB、促炎/骨吸收因子等，抑制炎癥性骨丟失的上游基因表達(dá)水平[21]。這些結(jié)果說明HIF-1α在牙周組織低氧環(huán)境下對(duì)骨代謝的重要調(diào)控作用，且隨著HIF-1α水平的改變其生理功能也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，而其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外，NF-κB通路是炎癥中骨吸收和破骨細(xì)胞產(chǎn)生的重要通路，且NF-κB是破骨細(xì)胞活性和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的核心轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)低氧可影響細(xì)胞中NF-κB和骨保護(hù)素的表達(dá)水平，進(jìn)一步促進(jìn)牙周炎的進(jìn)展[22-23]。許多研究證明低氧在牙周組織的細(xì)胞活力和骨重塑中的關(guān)鍵作用，但低氧是否促進(jìn)骨形成或骨吸收仍然存在爭(zhēng)議。我們認(rèn)為低氧初期對(duì)牙槽骨的影響以促進(jìn)作用為主，而后期以吸收作用為主。牙周炎相關(guān)骨吸收與低氧應(yīng)激存在密切關(guān)系，這為牙周炎導(dǎo)致的骨吸收提供了新的機(jī)制，同時(shí)為預(yù)防和治療牙槽骨丟失提供新的方向。

4 低氧對(duì)人牙周細(xì)胞凋亡和自噬的影響

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是基因控制的細(xì)胞程序性死亡，Bnip3基因被認(rèn)為是缺氧狀態(tài)下的初級(jí)促死亡基因(primary pro-death gene)，能在低氧環(huán)境下誘導(dǎo)表達(dá)。自噬(autophagy)是一種“自食”的胞內(nèi)機(jī)制，整個(gè)自噬過程主要受雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1和Beclin1復(fù)合體調(diào)節(jié)，LC3蛋白是目前常用的自噬標(biāo)記蛋白[24]。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α依賴性途徑和HIF-1α非依賴性途徑是低氧誘導(dǎo)自噬發(fā)生的兩條主要途徑，已證明缺氧條件下hPDLCs的自噬和凋亡與HIF-1α的激活明顯相關(guān)[1，25]。HIF-1通路的激活是抑制間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的有效保護(hù)途徑，低氧時(shí)凋亡抑制因子核仁蛋白3(apoptosis repressor nucleolar protein 3, NOL3)表達(dá)增加[26-27]，而自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值因低氧刺激升高，提示低氧環(huán)境對(duì)細(xì)胞凋亡起到一定的抑制作用，且在缺氧反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是細(xì)胞自噬。低氧培養(yǎng)環(huán)境中常發(fā)生成骨細(xì)胞及hPDLCs中線粒體腫脹和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，不僅導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)，還誘導(dǎo)線粒體的自噬作用和細(xì)胞凋亡活性，通過抑制線粒體的自噬作用可降低因低氧所誘導(dǎo)的凋亡活性[28]，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝和蛋白合成改變的重要原因，但其具體機(jī)制還需深入研究。研究根尖周病變時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α和BNIP3的表達(dá)均增加[25]，提示低氧可通過調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)介導(dǎo)自噬。

另外，在低氧環(huán)境下泛素相關(guān)酶和熱休克蛋白的表達(dá)參與自噬和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶E2、泛素相關(guān)蛋白1和泛素樣蛋白5等可靶向蛋白酶體降解的底物[29]，這可能對(duì)低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬起到一定的促進(jìn)作用。HSPA8作為伴侶介導(dǎo)的自噬中一個(gè)重要組成部分，可通過它將蛋白質(zhì)導(dǎo)入溶酶體，還能與HSPβ1和HSPA5等蛋白廣泛作用，協(xié)同發(fā)揮抗hPDLCs凋亡作用[30]，亦有研究發(fā)現(xiàn)HSP60也參與了牙周炎進(jìn)展和牙齒發(fā)育[31]。凋亡和自噬通常是細(xì)胞對(duì)刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，關(guān)于牙周炎所致低氧引起的牙周細(xì)胞凋亡和自噬機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，以求從一方面揭示牙周炎的發(fā)病機(jī)制。

5 低氧對(duì)牙周組織血管的影響

慢性炎癥引起牙周組織發(fā)生微循環(huán)障礙、低灌注，從而導(dǎo)致牙周組織低氧微環(huán)境形成。低氧能調(diào)節(jié)血管張力，被認(rèn)為是血管生成的有利刺激，已證明血管生成與低氧聯(lián)系緊密[32]，其中VEGF和HIF-1在該過程中發(fā)揮核心調(diào)控作用。低氧環(huán)境下HIF-1的激活和聚集可導(dǎo)致VEGF的轉(zhuǎn)錄激活，從而引導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移到低氧環(huán)境中，促進(jìn)血管新生以增加高氧血液向缺氧組織的輸送，VEGF作為血管生成的主要標(biāo)志物，也是HIF-1α主要的下游靶基因[33]。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路是VEGF調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)級(jí)聯(lián)，COX2/PGE2/VEGF信號(hào)通路可能參與了缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和旁分泌[8，34]。在低氧炎癥微環(huán)境下，活性HIF-1的不斷產(chǎn)生和核聚集還引發(fā)其下游基因的廣泛轉(zhuǎn)錄，參與血管生成及舒縮調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡、屏障及離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，HIF-1α也被認(rèn)為在成血管與成骨的耦合關(guān)系中起著重要的調(diào)節(jié)作用[18]。與健康牙齦相比，牙周炎組織中VEGF和HIF-1α的表達(dá)有明顯增加[35]，進(jìn)一步說明VEGF和HIF-1α在牙周炎組織血管再生中起關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)HIF-1α和HIF-2α在組織血管調(diào)控方面具有互補(bǔ)作用： HIF-1α促進(jìn)血管生長(zhǎng)，HIF-2α促進(jìn)血管成熟[36-37]。另外，牙周致病菌來源的肽聚糖導(dǎo)致牙周組織細(xì)胞TLR2激活，而炎癥環(huán)境下TLR2激活可顯著增強(qiáng)HIF-1α和BMP-2的表達(dá)，從而上調(diào)其下游成骨和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，以促進(jìn)牙槽骨骨血管生成和組織血管化[16]，這些研究結(jié)果提示牙周致病菌對(duì)牙周血管生成發(fā)揮間接作用。

研究表明，VEGF表達(dá)上調(diào)和血管新生在炎癥、傷口愈合和骨重塑中發(fā)揮重要的作用[38]。炎癥牙周組織的血管新生被認(rèn)為是牙周組織低氧下的適應(yīng)性表現(xiàn)。低氧培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞早期增殖情況與常氧組相似，但延長(zhǎng)缺氧后其增殖活性與前面提及的PDLCs具有相似的表型[39]。這些研究提示低氧對(duì)血管形成并非單一的促進(jìn)作用，而是在培養(yǎng)條件發(fā)生改變的情況下，其對(duì)機(jī)體的生理功能影響亦發(fā)生變化。

6 低氧與lncRNAs對(duì)牙周組織的影響

通常把長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA稱為lncRNA，其在維持干細(xì)胞分化和多能性方面具有重要生理作用[40]。牙周炎屬于低氧性疾病，而低氧與眾多l(xiāng)ncRNAs的表達(dá)存在密切聯(lián)系。低氧下不同lncRNA的生物學(xué)行為不同。如針對(duì)缺血性中風(fēng)的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-GAS5、lncRNA NR_120420、lncRNA NKILA在糖氧剝奪模擬條件下表達(dá)上調(diào)，并加重細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制還與mi-RNAs、si-RNAs以及NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)[41-43]；而lncRNA ANRIL的表達(dá)在糖氧剝奪后明顯降低，促進(jìn)其表達(dá)可減輕糖氧剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[44]。另外，lncRNA MALAT1可減輕糖氧剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，降低低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[45-46]。研究對(duì)牙周炎患者和正常人牙周組織樣本中的lncRNA進(jìn)行芯片篩查，發(fā)現(xiàn)lncRNA-01126在牙周炎組織中特異性高表達(dá)，提示低氧與某些lncRNA的差異性改變及生理功能存在關(guān)聯(lián)[47]。眾多研究還表明疾病的發(fā)展和預(yù)后與lncRNAs的表達(dá)有關(guān)，而lncRNAs的表達(dá)與組織低氧聯(lián)系緊密，如胃腸道腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷、腎細(xì)胞癌等[48-50]，其潛在機(jī)制的研究仍在不斷深入。

7 展 望

牙周炎作為眾多低氧性疾病中的一種，牙周組織低氧環(huán)境對(duì)牙周炎的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。一方面，低氧導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生損害性應(yīng)激(產(chǎn)生炎性因子和自由基、引起細(xì)胞自噬與凋亡、激活炎癥信號(hào)通路等方式)，從而導(dǎo)致牙周組織破壞。另一方面，機(jī)體在低氧條件下發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)(包括牙周細(xì)胞的成骨分化以促進(jìn)牙槽骨再生、缺氧耐受增強(qiáng)、細(xì)胞代謝相關(guān)酶活性提高以及牙周血管再生與改建等)。低氧與牙周炎有著緊密的聯(lián)系，近年來關(guān)于低氧與lncRNAs的研究也逐漸引入到牙周疾病方面。本綜述主要探討牙周組織低氧環(huán)境對(duì)牙周炎發(fā)生發(fā)展的影響及相關(guān)機(jī)制，希望為牙周炎的預(yù)防和治療提供新的思路。