降瑞嬋， 劉海亮,2,3

(1. 石河子大學生命科學學院新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832003；2. 同濟大學附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學研究所，上海 200123; 3. 同濟大學附屬東方醫(yī)院干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學產(chǎn)業(yè)基地，上海 200123)

甘草是東西方最古老、最常用的草本植物之一[1]。世界分布著30種甘草，亞洲是其中的中心區(qū)域[2]。它廣泛分布在伊朗、印度、哈薩克斯坦、俄羅斯、阿富汗、塔吉克斯坦、西班牙和吉爾吉斯斯坦[3]。目前，從甘草屬植物中分離得到的化合物有數(shù)百種，包括三萜皂苷、黃酮類、香豆素、生物堿等，具有保肝、抗炎、解毒等多種生物活性[4-5]。

個體衰老是一個復雜的過程，在這一過程中衰老細胞在組織中逐漸積累，繼而導致組織功能受損[6]。細胞衰老在多種生物學過程中發(fā)揮了重要的作用，是研究衰老的非常重要的切入點。許多研究表明，成體干細胞在維持機體健康和預防年齡相關疾病方面發(fā)揮著關鍵作用，但是它們的年代性退化導致其再生能力受損[7]。人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)是一種成人間充質(zhì)干細胞，具有與高度復制的骨髓源性干細胞(bone marrow-derived stem cells, BMSCs)相似的分化特性[8-9]。在研究和治療應用方面，hADSCs比其他干細胞具有多種優(yōu)勢。首先，hADSCs易于從皮下脂肪組織中分離，產(chǎn)量高，體外培養(yǎng)容易膨脹。其次，隨著年齡的增長，hADSCs的濃度和增殖率始終保持不變[10]。但其仍有一些不足之處，如干細胞自身具有局限性，隨著年齡增長，ADSCs的增殖和分化活力可能有所下降[11]，這就限制了hADSCs的實際應用。本研究使用體外試驗來探究烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草中的共有活性物質(zhì)甘草酸(GA)、甘草苷(LQ)、異甘草苷(ILQ)、芹糖甘草苷(LA)和芹糖異甘草苷(ILA)的抗衰老作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DMEM/F-12、胎牛血清、非必需氨基酸(NEAA)購自Gbico公司；倒置熒光顯微鏡購自尼康公司；細胞計數(shù)板購自Hausser Scientific公司；多功能酶標儀購自Molecular Devices公司；各種細胞培養(yǎng)器皿購自Corning公司；甘草酸、甘草苷、異甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷購自同田生物公司；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天公司；DNA提取試劑盒購自天根公司；成骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒、成脂誘導分化培養(yǎng)基試劑盒購自Cyagen公司；細胞ROS檢測試劑盒購自Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；hADSCs來自本實驗室。

1.2 CCK8法和Ki67染色檢測甘草中活性物質(zhì)對hADSCs增殖的影響

將hADSCs消化處理后制成細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，在透明96孔板中加入100 μL細胞懸液；在CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，使細胞貼壁；吸棄原培養(yǎng)基，并加入不同濃度梯度藥物培養(yǎng)基，以正常培養(yǎng)基作為對照組，每組設有6個復孔，CO2培養(yǎng)箱孵育24 h；吸棄藥物培養(yǎng)基，加入含10% CCK8的培養(yǎng)基；CO2培養(yǎng)箱孵育1～2 h，測定450 nm處D450值，計算細胞活力=(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔) × 100%。

將hADSCs接種在24孔板里，貼壁后去除原培養(yǎng)基，加入藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間；之后吸棄培養(yǎng)基，多聚甲醛固定液進行固定，并進行Ki67和DAPI染色。利用Image J進行統(tǒng)計，計算Ki67陽性細胞百分比。

1.3 RNA提取以及p16INK4a、p21、p53基因表達量檢測

將hADSCs種在6孔板里，貼壁后去除原培養(yǎng)基，加入藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間；之后吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗3～4次，加入700 μL TRIzol，放在搖晃機上緩慢搖5 min；加入200 μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置10 min，4 ℃，12 000×g，離心10 min，吸取上清液至另1離心管；加300 μL異丙醇，混勻，-20 ℃ 放置30 min，4 ℃，12 000×g，離心30 min，棄上清液；用75%乙醇清洗2～3次，吹干。反轉(zhuǎn)成cDNA，檢測p16、p21、p53的表達，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1。PCR反應體系及程序如下。

表1 人p16、p21、p53、β-actin引物序列Tab.1 Primers of human p16, p21, p53 and β-actin

qRT-PCR體系： 在10 μL體系中，加入cDNA 1 μL，10×上下游引物各0.25 μL，2×SYBR Green 5 μL，最后加水3.5 μL。qRT-PCR程序同文獻[12]。

1.4 ROS檢測

將hADSCs消化處理后制成細胞懸液，計數(shù)；調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，在不透明96孔板中加入100 μL細胞懸液；在CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，使細胞貼壁；吸棄原培養(yǎng)基，加入適宜濃度的藥物培養(yǎng)基，等待24 h；將ROS培養(yǎng)基提前拿出，從-20 ℃恢復至室溫，配制mix，將藥物培養(yǎng)基吸棄，配好的mix在96孔板中加入100 μL，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5～1 h；使用酶標儀測熒光量(λex=640/λem=675 nm)。

1.5 RNA測序

對每個樣本進行獨立且一致的RNA測序。在6孔板培養(yǎng)細胞，并加以活性物質(zhì)處理，24 h后吸棄培養(yǎng)基，用PBS沖洗2～3次，加700 μL TRIzol提取總RNA，并進行測序。使用bowtie-2將Clean reads與內(nèi)參基因序列比對，計算每個樣本的基因表達水平。DEGseq法進行差異基因表達檢測。統(tǒng)計結(jié)果以ma-plot法為基礎。隨機抽取樣本中獲得的特定基因reads數(shù)，根據(jù)正態(tài)分布計算p值，并修正為q值。為提高差異基因表達檢測的準確性，篩選差異倍數(shù)在2倍以上且q值≤0.001的基因，定義為差異表達顯著的基因。測序數(shù)據(jù)可以根據(jù)需要聯(lián)系通訊作者，予以提供。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 5種活性物質(zhì)對hADSCs增殖的影響

利用CCK8法并設置10個不同濃度來研究不同物質(zhì)作用于hADSCs增殖的最佳濃度。甘草酸、甘草苷、異甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷在ROS以及端粒相對長度的測定等實驗中的所使用濃度分別是3.125、3.125、3.125、3.125、6.25 μmol/L，見圖1。

圖1 不同濃度下活性物質(zhì)對hADSCs的影響Fig.1 Effects of active substances at different concentrations on hADSCsA： 甘草酸；B： 甘草苷；C： 異甘草苷；D： 芹糖甘草苷； E： 芹糖異甘草苷；A、B、C、D、E中橫坐標濃度為μmol/L

采用上述物質(zhì)相對應的適宜濃度對hADSCs進行培養(yǎng)，并進行Ki67染色，結(jié)果顯示，甘草酸處理后Ki67陽性細胞極顯著增加(P<0.001)；甘草苷和芹糖異甘草苷處理后Ki67陽性細胞顯著增加(P<0.01)；異甘草苷和芹糖甘草苷處理后Ki67陽性細胞顯著增加(P<0.05)，見圖2。

圖2 活性物質(zhì)處理對hADSCs中Ki67陽性細胞數(shù)目的影響Fig.2 Effect of active substance treatment on the number of Ki67-positive hADSCsA-F： Ki67染色圖；A： 甘草酸；B： 甘草苷；C： 異甘草苷；D： 芹糖甘草苷； E： 芹糖異甘草苷；G： Ki67陽性細胞數(shù)目統(tǒng)計

2.2 5種活性物質(zhì)對hADSCs中β-半乳糖苷酶的影響

衰老細胞通常體積變大，并表達在pH=6.0時有高酶活性的β-半乳糖苷酶。細胞衰老也被認為是生物體抑制腫瘤的一種方式，同時也是生物體老化的一種潛在原因。甘草酸等5種化合物可顯著降低衰老細胞比例(P<0.001)，藥物處理使衰老細胞比例由17%下降至10%及10%以下。其中甘草酸、甘草苷、異甘草苷和芹糖異甘草苷的抗衰老能力更強，見圖3。

圖3 活性物質(zhì)處理對hADSCs細胞β-半乳糖苷酶陽性細胞數(shù)目的影響Fig.3 Effect of active substance treatment on the number of β-galactosidase positivehADSCsA～F： β-半乳糖苷酶染色圖；A： 對照；B： 甘草酸；C： 甘草苷；D： 異甘草苷；E： 芹糖甘草苷； F： 芹糖異甘草苷；G： β-半乳糖苷酶陽性細胞數(shù)目柱狀統(tǒng)計圖

2.3 5種活性物質(zhì)對hADSCs內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

線粒體作為細胞呼吸、物質(zhì)氧化的重要場所，細胞內(nèi)約90% ATP來源于線粒體[13]；線粒體也是細胞內(nèi)ROS生成的主要場所，而ROS是影響干細胞衰老的重要因素[14]。利用ROS試劑盒檢測hADSCs內(nèi)ROS水平，經(jīng)芹糖甘草苷處理后細胞內(nèi)ROS水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，異甘草苷處理后細胞內(nèi)ROS水平顯著下降(P<0.01)，甘草酸、甘草苷以及芹糖異甘草苷處理后細胞內(nèi)ROS水平極顯著下降(P<0.001)，見圖4。

圖4 活性物質(zhì)處理對hADSCs內(nèi)ROS的影響Fig.4 Effect of active substance treatment on reactive oxygen species in hADSCs

2.4 5種活性物質(zhì)對hADSCs細胞周期的影響

分裂活躍的細胞中S和G2的比例很高，而G1期細胞則相對比較小。在經(jīng)化合物處理24 h后，細胞周期結(jié)果顯示，甘草酸、異甘草苷和芹糖甘草苷處理下，對細胞周期無影響(P>0.05)。芹糖異甘草苷能使處在G1期的細胞比例減少(P<0.05)，但其并未使處于S期和G2期的細胞比例增加(P>0.05)。甘草苷能使G1期比例有減少趨勢，但差異不存在統(tǒng)計學意義，并能使S期增加，但G2期細胞與對照無差異，但從S+G2期來看，甘草苷能使處在S和G2期細胞比例略微增加，但同樣不存在差異性(P>0.05)，見圖5。

圖5 活性物質(zhì)處理對hADSCs細胞周期的影響Fig.5 Effect of active substance treatment on cell cycle of hADSCs

2.5 5種活性物質(zhì)對hADSCs內(nèi)p16INK4a、p21、p53基因表達的影響

p16INK4a和p21是細胞周期蛋白激酶抑制劑家族的成員之一，它可以抑制CDK復合物的形成，從而導致細胞周期阻滯和凋亡[15]。5種化合物處理后測定hADSCs內(nèi)p16INK4a、p21、p53基因的表達量。5種化合物處理1天時甘草酸、甘草苷以及芹糖異甘草苷能使p16INK4a基因表達量降低(分別為P<0.05、P<0.01、P<0.05)。然而5種化合物處理對p21、p53基因表達量無顯著性差異(P>0.05)，見圖6。

圖6 活性物質(zhì)處理對hADSCs內(nèi)p16、p21、p53基因表達量的影響Fig.6 Effect of active substance treatment on the expression of p16, p21 and p53 genes in hADSCs

2.6 5種活性物質(zhì)對hADSCs端粒相對長度的影響

大多數(shù)人類細胞的端粒在體內(nèi)衰老過程中也會縮短，這表明端粒長度可能是衰老和與年齡相關的發(fā)病率的生物標志物[16]。在經(jīng)化合物處理24 h后，測量hADSCs端粒長度變化。甘草苷和異甘草苷處理后端粒相對長度與對照相比極顯著增加(P<0.001)，甘草酸處理后端粒長度與對照相比顯著增加(P<0.01)，見圖7。

圖7 活性物質(zhì)處理對hADSCs端粒相對長度的影響Fig.7 Effect of active substance treatment on relative telomere length of hADSCs

2.7 甘草酸、甘草苷以及芹糖異甘草苷對hADSCs定向分化的影響

以上實驗基礎上，挑選了甘草酸、甘草苷及芹糖異甘草苷等3種化合物進行hADSCs的定向分化。在hADSCs的成脂分化中，發(fā)現(xiàn)3種化合物都能使成脂率降低(P<0.001)，見圖8A。在hADSCs的成骨分化中，茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)甘草酸和芹糖異甘草苷能促進成骨分化的能力，見圖8C、 圖8E；而甘草苷則對成骨分化沒有明顯變化，見圖8D。

圖8 活性物質(zhì)處理對hADSCs成脂成骨分化的影響Fig.8 Effect of active substance treatment on adipogenic and osteogenic differentiation of hADSCsA～E為成脂分化誘導示意圖及統(tǒng)計柱狀圖(B： 對照；C： GA；D： LQ；E： ILA)；F～I為成骨分化誘導染色圖(F： 對照；G： GA；H： LQ；I： ILA)

2.8 甘草酸、甘草苷以及芹糖異甘草苷處理hADSCs后測序結(jié)果

在以上實驗基礎上，挑選了甘草酸、甘草苷以及芹糖異甘草苷三種化合物處理后的細胞進行測序。

在RNA-seq分析中，甘草酸處理后與對照相比有317個差異基因，其中上調(diào)基因有153個，下調(diào)基因有164個。對差異基因進行了KEGG通路富集氣泡分析，發(fā)現(xiàn)差異基因通路富集在抗原加工提呈、人類巨細胞病毒感染以及原發(fā)性免疫缺陷等。并對抗原加工提呈中的差異基因進行熱圖分析，發(fā)現(xiàn)甘草酸處理后hADSCs中CD8a的表達量增加，見圖9。

圖9 甘草酸測序結(jié)果分析Fig.9 The RNA-seq results of GA and control hADSCsA： 差異基因數(shù)目；B： KEGG通路富集分析氣泡圖；C： 抗原加工提呈熱圖分析

在甘草苷處理hADSCs后與對照相比差異基因共有322個，其中上調(diào)基因有155個，下調(diào)基因有167個。對差異基因進行了KEGG通路富集氣泡分析，發(fā)現(xiàn)這些基因與瘧疾及一些生物合成相關，見圖10。在這些通路中，還看到甘草苷處理可影響糖酵解和MAPK信號通路。

圖10 甘草苷測序結(jié)果分析Fig.10 The RNA-seq results of LQ and control hADSCs

在芹糖異甘草苷處理后與對照相比的321個差異基因中，上調(diào)基因有135個，下調(diào)基因有186個，對這些差異基因進行了KEGG通路富集氣泡圖分析，發(fā)現(xiàn)與抗原加工提呈相關性最大，并對其中的差異基因進行熱圖分析，發(fā)現(xiàn)芹糖異甘草苷處理可抑制了CD8a的表達量，見圖11。

圖11 芹糖異甘草苷測序結(jié)果分析Fig.11 The RNA-seq results of ILA and control hADSCsA： 差異基因數(shù)目；B： KEGG通路富集分析氣泡圖；C： 抗原加工提呈熱圖分析

3 討 論

本研究通過選取甘草內(nèi)5種活性物質(zhì)，利用CCK-8法測得了這些物質(zhì)作用于hADSCs的最佳濃度，并在此基礎上利用Ki67染色、β-半乳糖苷酶原位染色、細胞內(nèi)ROS、細胞周期等實驗研究了它們的抗衰老作用。發(fā)現(xiàn)這5種化合物在體外都有不同程度的抗衰老作用，并且5種活性物質(zhì)中，甘草酸的抗衰老效果最佳，其次是甘草苷和芹糖異甘草苷。在以往對甘草活性物質(zhì)的研究中，對芹糖甘草苷和芹糖異甘草苷的研究較少，本實驗首先在細胞層次上研究了它們與抗衰老的聯(lián)系。

細胞衰老過程中，氧化應激的增加是導致細胞和細胞外基質(zhì)的損失的唯一最有害老化因素[17]。當ROS水平超過防御機制時，細胞就被認為處于氧化應激狀態(tài)。在環(huán)境脅迫下，增強ROS的產(chǎn)生會對細胞造成威脅，導致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和核酸損傷，最終導致細胞死亡。處理過量的ROS可以改善細胞代謝，從而延長壽命[18-19]。本實驗觀察到甘草酸、甘草苷、異甘草苷以及芹糖異甘草苷都能使細胞內(nèi)ROS水平降低，這一結(jié)果顯示這4種活性物質(zhì)可能通過氧化應激途徑來延緩細胞衰老，并且此結(jié)果預示著這4種藥物可能在體內(nèi)具有很好的抗衰老作用。在以前的體內(nèi)實驗中，已發(fā)現(xiàn)甘草酸能清除ROS[20]，甘草苷具有抗氧化和抗凋亡作用[21]，這些均證明了甘草酸和甘草苷等具有重要研究意義。本研究在細胞實驗中觀察到芹糖異甘草苷具有抗衰老作用，這揭示其有著更大的研究意義。

RNA測序結(jié)果顯示，甘草酸、甘草苷和芹糖異甘草它們與人類疾病之間具有密切相關性。其中甘草酸增加了CD8a的表達量，本研究在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)了甘草酸能增加體內(nèi)T細胞數(shù)目，這一結(jié)果與細胞實驗結(jié)果一致。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸還能促進調(diào)節(jié)T細胞的增殖[22]，這與本研究結(jié)果相似。甘草酸提高免疫細胞數(shù)目具有何作用，并通過什么途徑起作用需要進一步進行研究。本研究測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)芹糖異甘草苷能抑制CD8a表達，那么其在體內(nèi)是否具有其他的功效，如是否有抑制腫瘤作用，則需要進一步研究。

衰老對脂肪細胞和脂肪組織穩(wěn)態(tài)的影響尚不清楚，但年齡相關的脂肪功能障礙是眾多代謝和其他紊亂的重要原因，這一點已被廣泛接受[8]。在這些情況下，找到一種能夠?qū)垢杉毎ダ喜⒒謴推湓偕鷿摿Φ奶烊划a(chǎn)物，可能對衰老相關疾病的干預和維持干細胞功能[23]產(chǎn)生巨大影響。本研究首次觀察了在體外甘草中物質(zhì)對hADSCs衰老的作用，結(jié)果提示甘草酸等可通過保護線粒體功能和調(diào)節(jié)胞內(nèi)免疫對抗hADSCs衰老。本研究為從線粒體和免疫角度探尋阻止hADSCs衰老的有效方法提供了有價值的數(shù)據(jù)。