饒紫琦，劉菁，陳炳林，鄧永然，劉文其

肺癌的發(fā)病率、病死率均居全球惡性腫瘤的首位，目前主要是以手術(shù)、放療、化療以及靶向治療為主的綜合治療，但總體生存率仍然較低。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）一直以來被認(rèn)為是癌癥的主要標(biāo)志，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中均起著重要的作用，而巨噬細(xì)胞是TME系統(tǒng)中最重要的免疫炎性細(xì)胞群之一［1］。巨噬細(xì)胞由單核細(xì)胞分化而來，不同于其他免疫細(xì)胞，其最大特征是具有極強(qiáng)的功能異質(zhì)性和可塑性，并能夠根據(jù)機(jī)體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境中的信號(hào)被分化為不同功能的細(xì)胞亞群，即經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞與替代活化的M2型巨噬細(xì)胞［2］。M1型巨噬細(xì)胞通過分泌多種促炎性因子、趨化因子等參與炎癥和宿主免疫反應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞則分泌抑制性細(xì)胞因子，下調(diào)免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［3］。然而，巨噬細(xì)胞在維持表型平衡的過程中受多種因素及機(jī)制的影響。

熱療是繼傳統(tǒng)治療方式后的一種新興、無創(chuàng)、綠色的癌癥治療方式，目前已被廣泛運(yùn)用于各種腫瘤的輔助治療中，得到了許多臨床醫(yī)生及科研學(xué)者的廣泛關(guān)注［4］。熱療過去被認(rèn)為可以對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行直接殺傷，通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖生長，促進(jìn)凋亡，改善TME中的低pH值、乏氧狀態(tài)，增加腫瘤的血流灌注和氧合［5］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，熱療還可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng)［6］。有研究表明，熱療不僅能直接作用于腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，還能調(diào)節(jié)機(jī)體微環(huán)境中各種免疫細(xì)胞的活性，包括T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）和抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）等［7］。因此，推測熱療帶來的熱效應(yīng)能作用于TME，調(diào)控巨噬細(xì)胞的表型及對腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生抑制作用。目前，TME以及免疫治療對于以往直接靶向治療腫瘤細(xì)胞是一種新的思路，熱療是如何改善TME、提高機(jī)體免疫反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制仍然需要通過大量的研究來探索。本研究從分子和細(xì)胞的角度初步探討熱療對M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用，分析熱療抗腫瘤的免疫機(jī)制，探索熱療在治療腫瘤方面的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究時(shí)間 2019年6—12月。

1.2 材料 RAW264.7細(xì)胞（M0型巨噬細(xì)胞）購自中國科學(xué)院，由廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室保存，小鼠肺癌細(xì)胞（LLC）購自ATCC，DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，小鼠干擾素γ（IFN-γ）、小鼠白介素（IL）-4購自Peprotech公司，小鼠脂多糖（LPS）購自Sigma，PE標(biāo)記的抗小鼠CD86〔CD86（B7-2）Monoclonal Antibody（GL1），F(xiàn)ITC，eBioscience）〕和APC標(biāo)記的抗小鼠CD206抗體〔（CD206（MMR）Monoclonal Antibody（MR6F3），APC，eBioscience）〕購自賽默飛世爾科技公司，Transwell小室及培養(yǎng)板、Corning Incorporated、細(xì)胞增殖活力試劑盒（CCK-8）購自Sigma公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitative PCR，RT-PCR）試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 RAW264.7細(xì)胞株的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，于37 ℃，5%CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 RAW264.7細(xì)胞用含100 ml/L胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)并傳代；3×105/ml的RAW264.7細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，24 h后移去RAW264.7細(xì)胞中的培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2次。加入IFN-γ（10 000 ng/L）、LPS（100 000 ng/L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h為M1型巨噬細(xì)胞；加入IL-4（20 000 ng/L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h為M2型巨噬細(xì)胞。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD86、CD206表達(dá)率 收集不同誘導(dǎo)處理的RAW264.7細(xì)胞，用PBS清洗2次，分析表面標(biāo)志抗原CD86、CD206的表達(dá)。參考抗體說明書，加入熒光素偶聯(lián)的抗體，4 ℃避光孵育30 min。對細(xì)胞內(nèi)分子進(jìn)行染色，先加入固定/透膜緩沖液200 μl，混勻并重懸細(xì)胞，4 ℃孵育30 min，洗滌3次，分別加入抗小鼠CD86和CD206抗體，4 ℃避光孵育30 min。PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果用Flow Jo 7.6.1軟件分析。

1.3.4 ELISA法檢測M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10、IL-12分泌水平 按照試劑盒說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。測定450 nm波長處吸光度（OD）值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10、IL-12分泌水平。

1.3.5 細(xì)胞熱療及分組 將細(xì)胞置于41 ℃、42 ℃、43 ℃恒溫循環(huán)水浴鍋中分別孵育1 h，然后放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)溫繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為空白對照（37 ℃）組，熱療（41 ℃、42 ℃、43 ℃）組。

1.3.6 CCK-8法檢測熱療對M2型巨噬細(xì)胞增殖活性的影響 調(diào)整RAW264.7細(xì)胞濃度1×104/ml，加入96孔板內(nèi)，200 μl/孔，貼壁過夜培養(yǎng)。每孔加入CCK-8溶液（5 mg/ml用PBS配制，pH 7.4），37 ℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。在熱療時(shí)、熱療后24、48、72 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量OD值。酶聯(lián)免疫檢測儀選用450 nm波長，測定各孔OD值，計(jì)算熱療后各溫度處理組的細(xì)胞存活率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值記錄結(jié)果。

1.3.7 RT-PCR檢測M0、M2型巨噬細(xì)胞及熱療（42 ℃）后M2型巨噬細(xì)胞Ym-1、Arg-1、Fizz-1 mRNA相對表達(dá)水平 取RAW264.7細(xì)胞，分組及誘導(dǎo)方法同上，貼壁生長過夜后，按照TRIzol 說明書提取細(xì)胞總RNA，按Primescript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書降RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列見表1，RT-PCR反應(yīng)體系及條件參照SYBR Premix Ex TapTM 試劑盒（TaKaRa公司），以GAPDH 作為內(nèi)參，以M0型巨噬細(xì)胞各目的基因的表達(dá)量為對照，采用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA 的相對表達(dá)量［8］，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers for RT-PCR and their amplification size

1.3.8 Western blotting法檢測M2型巨噬細(xì)胞、熱療（42 ℃）后M2型巨噬細(xì)胞Ym-1、Arg-1、Fizz-1的蛋白相對表達(dá)水平 誘導(dǎo)分組〔M2型巨噬細(xì)胞、熱療（42 ℃）后M2型巨噬細(xì)胞〕干預(yù)后，提取各組細(xì)胞總蛋白，Western blotting法檢測熱療前后Ym-1、Arg-1、Fizz-1蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3.9 Transwell法檢測LLC、LLC+M2、LLC+M2+熱療（42 ℃）中LLC的侵襲、遷移能力 誘導(dǎo)分組〔LLC、M2型巨噬細(xì)胞與LLC共培養(yǎng)（LLC+M2）、LLC+M2+熱療〕干預(yù)后，按照Transwell說明書，調(diào)整細(xì)胞濃度后種在上室，下室加入培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱8 h、24 h后分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察M2型巨噬細(xì)胞、熱療（42 ℃）對LLC的侵襲、遷移能力的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用（±s）表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同誘導(dǎo)分化狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞形態(tài) 顯微鏡下觀察到M1型巨噬細(xì)胞形態(tài)，24 h后開始向周圍放射狀生長并伸出偽足，胞體由圓形變成紡錘狀、梭形，細(xì)胞體積較M0型巨噬細(xì)胞大，在培養(yǎng)液中半貼壁生長；M2型巨噬細(xì)胞的體積較M0型巨噬細(xì)胞大，形狀呈或類似成纖維狀，偽足較M1型巨噬細(xì)胞短，呈聚團(tuán)生長（見圖1）。

圖1 不同誘導(dǎo)分化狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞形態(tài)（結(jié)晶紫染色，×200）Figure 1 Macrophages morphology in different activation states

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD86、CD206表達(dá)率 不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞M0、M1和M2 CD86表達(dá)率分別為6.13%±1.83%、3.24%±0.76%和16.46%±3.11%。M2型巨噬細(xì)胞CD86表達(dá)率高于M0、M1型巨噬細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001， 見 圖 2）。M0、M1、M2型 巨 噬 細(xì) 胞CD206的表達(dá)率分別為3.87%±1.02%、1.01%±0.57%和41.83%±6.73%。M2型巨噬細(xì)胞CD206表達(dá)率高于M0、M1型巨噬細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖3）。

圖2 不同誘導(dǎo)分化狀態(tài)下巨噬細(xì)胞中CD86表達(dá)情況Figure 2 CD86 expression of different activated macrophages

圖3 不同誘導(dǎo)分化狀態(tài)下巨噬細(xì)胞中CD206表達(dá)情況Figure 3 CD206 expression of different activated macrophages

2.3 ELISA法檢測M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10、IL-12分泌水平 ELISA法檢測結(jié)果顯示，M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞上清液中培養(yǎng)IL-10分泌水平分別為（670±50）ng/L、（619±42）ng/L、（770±46）ng/L，IL-12分泌水平分別為（33±2）ng/L、（49±3）ng/L、（41±2）ng/L。M2型巨噬細(xì)胞IL-10分泌水平較M0和M1型巨噬細(xì)胞高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；M1型巨噬細(xì)胞IL-12分泌水平較M0和M2型巨噬細(xì)胞高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖4）。

圖4 不同誘導(dǎo)活化狀態(tài)下巨噬細(xì)胞IL-10與IL-12的分泌水平Figure 4 The secretion levels of IL-10 and IL-12 in macrophages under different activation states

2.4 CCK-8法檢測熱療（42 ℃）后M2巨噬細(xì)胞增殖活性 熱療后（41 ℃、42 ℃、43 ℃）M2型巨噬細(xì)胞的OD值低于37 ℃時(shí)的OD值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。72 h時(shí)42 ℃熱療對巨噬細(xì)胞增殖活性的抑制效果高于37 ℃、41 ℃、43 ℃時(shí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖5）。

圖5 不同溫度的熱療對巨噬細(xì)胞增殖活性的影響Figure 5 The effect of hyperthermia at different temperatures on macrophage proliferation

2.5 RT-PCR檢測M0、M2型巨噬細(xì)胞及熱療（42 ℃）后M2型巨噬細(xì)胞Ym-1、Arg-1、Fizz-1 mRNA的相對表達(dá)水平 M2型巨噬細(xì)胞的Ym-1、Arg-1、Fizz-1 mRNA相對表達(dá)水平高于M0型巨噬細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。熱療（42 ℃）后M2型巨噬細(xì)胞的Ym-1、Arg-1 mRNA相對表達(dá)水平低于熱療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖6）。

圖6 M0型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞及熱療后M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子的相對表達(dá)量Figure 6 Relative expression of M0 macrophages，M2 macrophages and M2 macrophages after hyperthermia related factors

2.6 Western blotting法檢測M2型巨噬細(xì)胞、熱療（42 ℃）后M2型巨噬細(xì)胞Ym-1、Arg-1、Fizz-1蛋白相對表達(dá)水平 熱療（42 ℃）后M2型巨噬細(xì)胞Ym-1、Arg-1蛋白相對表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014，P=0.029，見圖7）。

圖7 M2巨噬細(xì)胞及熱療后M2巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白情況Figure 7 M2 macrophages and M2 macrophages after hyperthermia related proteins

2.7 Transwell法檢測LLC、LLC+M2、LLC+M2+熱療（42 ℃）中LLC的侵襲、遷移能力

2.7.1 M2型巨噬細(xì)胞對LLC侵襲能力的影響 LLC和LLC+M2中LLC侵襲細(xì)胞數(shù)分別為：（38±4）個(gè)和（85±6）個(gè)。LLC+M2中LLC侵襲細(xì)胞數(shù)較LLC增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖8）。

圖8 M2型巨噬細(xì)胞對LLC侵襲能力的影響Figure 8 The effect of M2 macrophages on invasion ability of LCCs

2.7.2 熱療對LLC侵襲能力的影響 LLC+M2和LLC+M2+熱療中LLC侵襲細(xì)胞數(shù)分別為：（85±6）個(gè)和（24±4）個(gè)。LLC+M2+熱療中LLC侵襲細(xì)胞數(shù)較LLC+M2減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖9）。

圖9 熱療對LLC侵襲能力的影響Figure 9 The effect of hyperthermia on invasion ability of LCCs

2.7.3 M2巨噬細(xì)胞對LLC遷移能力的影響 LLC和LLC+M2中LLC遷移細(xì)胞數(shù)分別為：（92±5）個(gè)和（132±6）個(gè)。LLC+M2中LLC遷移細(xì)胞數(shù)較LLC增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖10）。

圖10 M2型巨噬細(xì)胞對LLC遷移能力的影響Figure 10 The effect of M2 macrophages on migration ability of LCCs

2.7.4 熱療對LLC遷移能力的影響 LLC+M2和LLC+M2+熱療中LLC遷移細(xì)胞數(shù)分別為：（85±6）個(gè)和（24±4）個(gè)。LLC+M2+熱療中LLC遷移細(xì)胞數(shù)較LLC+M2減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖11）。

圖11 熱療對LLC遷移能力的影響Figure 11 The effect of hyperthermia on migration ability of LCCs

3 討論

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）在微環(huán)境中對腫瘤的具體作用是雙重且呈動(dòng)態(tài)變化的，且作為微環(huán)境中重要的侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素啟動(dòng)子，其幾乎參與了腫瘤進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移所有的級(jí)聯(lián)步驟。在越來越多的研究中報(bào)道［7，9］，熱療能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤血流灌注、淋巴細(xì)胞的運(yùn)輸、炎性因子的表達(dá)、淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，增強(qiáng)先天和適應(yīng)性免疫功能從而積極廣泛地影響腫瘤免疫微環(huán)境［10］。本實(shí)驗(yàn)表明42 ℃熱療可以抑制因子Ym-1、Arg-1、Fizz-1的mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平，說明熱療能夠使巨噬細(xì)胞的表型發(fā)生改變，減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)生理機(jī)能、維持各項(xiàng)功能的動(dòng)態(tài)平衡、炎性反應(yīng)中是不可或缺的一部分。特異性和可塑性是巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)，在不同微環(huán)境和細(xì)胞因子的綜合影響下，巨噬細(xì)胞可以極化成不同類型，即經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型具有釋放促炎因子、調(diào)節(jié)Th1型免疫、抗原的提呈等功能；而M2型則表現(xiàn)出“抑炎”功能，可以促進(jìn)血管生成和組織修復(fù)。IL-4、IL-13等均可刺激巨噬細(xì)胞實(shí)現(xiàn)M2型極化，STAT6信號(hào)通路在被IL-4/IL-13激活后可以增加M2型極化所必需的相關(guān)基因表達(dá)，如Ym-1、Fizz-1、Agr-1［11］。STAT6 是 IL-4/IL-13 介導(dǎo)的 M2 型巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。IL-4和IL-4Rα結(jié)合激活 Janus 激酶1（Janus kinase 1，JAK1）/JAK3或JAK1/酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，Tyk2），促進(jìn)胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）的聚集，進(jìn)而使 STAT6 酪氨酸磷酸化并形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)包括 Arg-1、CD206、Fizz-1及Ym-1在內(nèi)的相關(guān)因子的表達(dá)［12］。本研究采用侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，首先觀察M2型TAMs對LLC共培養(yǎng)后的侵襲、遷移能力的變化。通過Transwell共培養(yǎng)的結(jié)果觀察到，M2型巨噬細(xì)胞對促進(jìn)LLC細(xì)胞的侵襲與遷移作用明顯，與既往研究報(bào)道相符［13］。在此基礎(chǔ)上，行42 ℃水浴加熱干預(yù)，結(jié)果提示熱療能夠抑制LLC的侵襲和遷移。在ZHANG等［14］的研究中發(fā)現(xiàn)缺氧微環(huán)境能夠通過ERK信號(hào)的激活使巨噬細(xì)胞從M1型向M2型偏轉(zhuǎn)，從而促進(jìn)LLC在體內(nèi)和體外的侵襲轉(zhuǎn)移。由于缺氧能夠介導(dǎo)侵襲性腫瘤行為，促使M1型向M2型TAMs表型的極化，而熱療能夠改善腫瘤組織乏氧環(huán)境已被許多研究所明確，所以推測熱療可能是通過對乏氧的改善從而抑制LLC的侵襲與遷移，但具體機(jī)制是怎樣的？仍需要更多的研究進(jìn)一步闡明。

綜上所述，熱療在TME中有著重要的免疫調(diào)節(jié)功能，探討熱療調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)機(jī)制，不僅有利于對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識(shí)，還可以通過合理干預(yù)巨噬細(xì)胞極化過程中的某些關(guān)鍵步驟，扭轉(zhuǎn)M1/M2型巨噬細(xì)胞間偏移的極化失衡狀態(tài)，可為治療多種腫瘤提供新的角度和思路。

作者貢獻(xiàn)：饒紫琦進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；劉菁進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；陳炳林進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；鄧永然進(jìn)行論文的修訂；劉文其負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。