逄琳，陳新，王艷，呂秀娟

(沈陽市第四人民醫(yī)院干診科，遼寧 沈陽 110000)

0 引言

中國是胃癌大國，每年新發(fā)病例以及胃癌相關(guān)死亡事件分別占到世界總數(shù)的47%和48%。我國胃癌成為第二大常見癌癥及第三大死因[1,2]。目前胃癌的治療效果較差，晚期胃癌中位生存時間仍未突破16個月，仍需進一步探索新的治療手段。目前進行新型癌癥藥物的開發(fā)非常昂貴且耗時，隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，包括基因組學、蛋白組學、代謝組學等研究給胃癌的病因探索和診療策略的研究帶來了突飛猛進的變化[3,4]。新技術(shù)的發(fā)展為胃癌藥物臨床帶來了新的機遇，分子靶向藥物的研究如火如荼，新靶點藥物層出不窮。進入靶向時代二十年來，胃癌患者生存期的延長、生活質(zhì)量的提高，進步很大，但仍然很有限，有效的靶向藥物還很少。如何加快抗胃癌藥物的研發(fā)速度，迎接挑戰(zhàn)，克服新藥研發(fā)的困境是近期的努力方向。用于治療其它疾病的藥物進行重新定位或許有望用于治療胃癌。雙硫侖就是一種便宜、安全且具有悠久歷史的戒酒藥物，國內(nèi)外已有多篇論文證實了雙硫侖藥物在乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等惡性腫瘤中的抗癌作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)雙硫侖的細胞毒性依賴于銅(Cu)[5,6]。由于它是一種二價金屬螯合劑，所以研究認為雙硫侖與Cu形成一種更容易被細胞吸收的復合物。雙硫侖及其代謝產(chǎn)物均可誘導氧化應激，而氧化應激已被證實可以調(diào)節(jié)自噬和凋亡[7,8]。自噬和凋亡之間有著親密的相互作用，他們擁有相似的效應器和調(diào)節(jié)因子。有望通過本項研究將進一步探討其在胃癌腫瘤細胞中的抗癌活性及其機制。

雙硫侖在臨床中一直被用作一線戒酒藥物，沒有嚴重的副作用，近期有研究發(fā)現(xiàn)，患有腫瘤的患者中同時服用雙硫侖藥物戒酒的患者生存期明顯優(yōu)于未服用者。本研究主要探索其抗腫瘤的機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究選取沈陽市第四人民醫(yī)院2018年～2019年就診的確診胃癌患者，并留取胃癌細胞，體外培養(yǎng)胃癌細胞，用分別不同濃度的雙硫侖與Cu對胃癌細胞進行作用，采用MTT法檢查胃癌細胞的細胞活力與細胞增殖率，確定各自最佳劑量與效應的關(guān)系。

1.2 研究方法及觀察指標

觀察雙硫侖聯(lián)合Cu對胃癌細胞增殖與移行的作用；觀察雙硫侖聯(lián)合Cu對胃癌細胞凋亡與自噬的作用；探討自噬與凋亡在胃癌細胞增殖過程中的相互影響與作用。研究中采用免疫熒光結(jié)合單克隆抗體方法對胃癌細胞進行鑒定。使用相應最佳濃度作用于胃癌細胞后，進行凋亡與自噬相關(guān)指標檢測：流式細胞儀通過Annexin-V和PI雙染色檢測Casepas-3、Casepas-8的變化，同時用Western-blot和Realtime-PCR檢測凋亡與自噬相關(guān)蛋白等(Caspase -3、Caspase-8、LC3B)的表達。用免疫熒光法對胃癌相關(guān)自噬小體進行定位于半定量分析(LC3B)。

1.3 統(tǒng)計分析

研究使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包分析研究數(shù)據(jù)，多組數(shù)據(jù)之間差別比較使用F檢驗(計量資料)以及卡方檢驗(計數(shù)資料以及等級資料)；研究的檢驗水準均使用P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 雙硫侖聯(lián)合Cu作用后胃癌細胞細胞活性與增殖率

IC50擬合曲線結(jié)果胃癌細胞24h的IC50為0.340μmol/L。采用CCK-8法檢測聯(lián)合用藥對細胞增殖抑制的劑量依賴性。藥物濃度為1，2，3和5μmol/L的抑制率分別為(80.45±0.88)%， (82.98±0.97)%，(81.35±0.95)%和(86.12±0.74)%；可見觀察組抑制作用較對照組明顯增強。詳見表1所示。

表1 觀察組與對照組抑制率分布情況(%)

2.2 雙硫侖聯(lián)合Cu作用后胃癌細胞的細胞凋亡率變化

觀察組可見流式細胞儀檢測在胃癌細胞中，藥物濃度為0，1，3和5μmol/L的凋亡率分別為(7.04±0.50)%，(9.03±0.48)%，(13.18±0.65)%和(14.42±0.19)%。藥物誘導24 h后細胞出現(xiàn)胞體變圓、縮小和脫落。

2.3 觀察組及對照組Casepas-3Casepas-8蛋白表達分布情況

本次研究結(jié)果還提示，觀察組Casepas-3 Casepas-8蛋白表達分別為(8.98±1.09)mL/mg和(3.09±1.31)mL/mg；對照組Casepas-3 Casepas-8蛋白表達分別為(13.22±1.43)mL/mg和(16.05±1.55)mL/mg；Casepas-3蛋白表達在觀察組顯著更低，而Casepas-8蛋白表達則可見在觀察組顯著更高。詳見表3所示。

表2 觀察組劑對照組凋亡率分布情況(%)

表3 兩組Casepas-3 Casepas-8蛋白表達分布情況(mL/mg)

2.4 觀察組及對照組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達分布情況

本次研究結(jié)果還提示，Western blot檢測觀察組胃癌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達，可見在藥物0.5、1、2、和4umol/L濃度下，相對表達量分別為(74.90±0.64)、(82.09±0.52)、(90.37±0.62)和(110.64±0.59)；此外對照組胃癌細胞該蛋白表達相對表達量為(30.24±0.59)，如表4所示。

表4 觀察組及對照組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達分布情況

3 討論

雙硫侖(disulfiram，DSF)為常見的戒酒藥，1948年Jacobsen等發(fā)現(xiàn)人體吸收少量雙硫侖可引起面部潮紅、頭痛、腹痛、出汗、呼吸困難等癥狀，飲酒后這些癥狀會更加明顯，攝入DSF后的飲酒癥狀稱也因此被稱為雙硫侖樣反應[9]。雙硫侖作為二價過渡金屬離子螯合劑，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤功效；當DSF 聯(lián)合二價銅離子、鋅離子、鉻離子等金屬離子時，抑制腫瘤效果更為顯著，但其抑制腫瘤生長機制具有種屬及細胞特異性[5,10]。DSF價格低廉、同時細胞毒性低及良好的抗腫瘤效果等優(yōu)勢，有望作為抗腫瘤藥物應用于臨床。但其也有不足之處，比如DSF水溶性差，在體內(nèi)存在穩(wěn)定性欠佳，等等。

流行病學數(shù)據(jù)提示，胃癌高發(fā)與發(fā)展中國家及經(jīng)濟發(fā)展水平較差的地區(qū)[11]；雙硫侖作為一種經(jīng)典藥物，價格相對低廉，如果能證實其可以在體外殺傷胃癌細胞則為今后其應用于臨床提供了理論基礎(chǔ)，從而減輕政府及患者的經(jīng)濟負擔[9,10]。本次研究即圍繞雙硫侖與Cu的各自最佳劑量與協(xié)同劑量，同時確定藥物作用時間與給藥時間點等展開分析討論，力爭完成藥物配伍，同時對藥物作用后的胃癌細胞進行增殖、遷移相關(guān)實驗，對細胞形態(tài)進行光鏡與電鏡觀察，對自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達與基因表達指標進行檢測，就機理進行深入分析。本次研究結(jié)果提示，IC50擬合曲線結(jié)果胃癌細胞24h的IC50為0.340μmol/L。采用CCK-8法檢測聯(lián)合用藥對細胞增殖抑制的劑量依賴性。藥物濃度為1，2，3 和5μmol/L的抑制率分別為(80.45±0.88)%，(82.98±0.97)%，(81.35±0.95)% 和(86.12±0.74)%；可見觀察組抑制作用較對照組明顯增強。觀察組可見流式細胞儀檢測在胃癌細胞中，藥物濃度為0，1，3和5μmol/L的凋亡率分別為(7.04±0.50)%，(9.03±0.48)%，(13.18±0.65)%和(14.42±0.19)%。藥物誘導24h后細胞出現(xiàn)胞體變圓、縮小和脫落。充分提示Cu雙硫侖聯(lián)合作用可以充分抑制胃癌細胞并誘導其發(fā)生凋亡。

本次研究結(jié)果還提示，觀察組Casepas-3 Casepas-8蛋白表達分別為(8.98±1.09)mL/mg和(3.09±1.31)mL/mg；對照組 Casepas-3 Casepas-8蛋白表達分別為(13.22±1.43)mL/mg和 (16.05±1.55)mL/mg；Casepas-3蛋白表達在觀察組顯著更低，而Casepas-8蛋白表達則可見在觀察組顯著更高。Western blot檢測觀察組胃癌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達，可見在藥物0.5、1、2、和4umol/L濃度下，相 對表達量分 別為 (74.90±0.64)、(82.09±0.52)、(90.37±0.62)和(110.64±0.59)；此 外對照組胃癌細胞該蛋白表達相對表達量為(30.24±0.59)?？梢奀u雙硫侖的促進胃癌細胞凋亡達到抑制腫瘤目的的潛在機理與下調(diào)Casepas-3蛋白表達以及上調(diào)Casepas-8蛋白表達，并進而上調(diào)自噬相關(guān)蛋白(比如LC3B-Ⅱ)存在關(guān)聯(lián)，是可能的作用機制。

本研究的主要內(nèi)容為探索藥物的抗腫瘤機制，故以社會效益為主，旨在探索新的治療方式，為胃癌患者帶來福音。研究結(jié)果充分提示Cu雙硫侖聯(lián)合作用可以充分抑制胃癌細胞并誘導其發(fā)生凋亡；主要機理與Cu雙硫侖的促進胃癌細胞凋亡達到抑制腫瘤目的的潛在機理與下調(diào)Casepas-3蛋白表達以及上調(diào)Casepas-8蛋白表達，并進而上調(diào)自噬相關(guān)蛋白(比如LC3B-Ⅱ)存在關(guān)聯(lián)。另外，本次研究創(chuàng)新點與特色還表現(xiàn)在胃癌現(xiàn)有的治療手段以手術(shù)為主，由于胃鏡檢查在我國體檢中并不作為常規(guī)檢查項目，因此很多患者首次發(fā)現(xiàn)時已失去手術(shù)機會。對于中晚期胃癌以化療及靶向治療為主。已經(jīng)批準用于胃癌治療的靶向藥物僅有曲妥珠單抗、阿帕替尼及Ramuciremab.在全球范圍內(nèi)胃癌的藥物臨床研究很多但成功的寥寥無幾，多種因素限制了胃癌新藥的臨床研發(fā)。本項目的創(chuàng)新點在于老藥新用，可以大大節(jié)省研發(fā)新藥的費用。