徐寧，邵素菊，華金雙，王培育，張君，任重，胡曉京，田麗

(1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

支氣管哮喘是臨床常見的慢性呼吸道疾病之一，是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。臨床癥狀常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性的氣急、喘息、胸悶或咳嗽等，在夜間或清晨最為多發(fā)[2]。哮喘的發(fā)生與氣道壁Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的激活密切相關(guān)。白介素-13(IL-13)是引起哮喘患者氣道炎癥發(fā)生和發(fā)展的重要炎癥因子[3]，其誘導(dǎo)過敏反應(yīng)是通過嗜酸粒細(xì)胞、IgE介導(dǎo)的反應(yīng)[4]。STAT6作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等多個過程，是哮喘發(fā)生發(fā)展過程中的重要轉(zhuǎn)錄激活因子[5]。本實驗所選腧穴肺俞、大椎、風(fēng)門是國家名老中醫(yī)邵經(jīng)明教授經(jīng)過幾十年的臨床及實驗研究總結(jié)出來的治療哮喘的經(jīng)驗有效穴，該穴組經(jīng)過大量實驗研究，已證實其可以緩解氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性，改善氣道重塑，其治療哮喘是通過多途徑、多靶點實現(xiàn)的[6-7]。IL-13及STAT6 mRNA參與了多種氣道炎癥，在哮喘中發(fā)揮著重要作用，本實驗通過觀察針灸對哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺組織STAT6 mRNA表達(dá)的影響，探討“邵氏五針法”改善哮喘癥狀及治療哮喘的作用機(jī)制，為針灸治療哮喘提供更為科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取成年雄性SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量160～180 g。購買后在通風(fēng)良好、適宜的溫度和濕度環(huán)境中分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，根據(jù)計算機(jī)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組10只、模型組10只、針刺組10只和艾灸組10只。

1.2 主要試劑與儀器

卵蛋白(美國Sigma公司)；31號一次性毫針(0.30 mm×13 mm,中研太和)；細(xì)艾條(0.7 cm×10 cm南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司)；IL-13 ELISA檢測試劑盒(CK-E30477R)；切片機(jī)(德國徠卡公司)；彩色圖像分析系統(tǒng)(西安華海電子有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號：CX21)；霧化器(遼寧省鞍山無線電一廠)；RT-PCR試劑盒(TransgelCHINA)；β-actin引物(賽百盛)；熒光定量PCR儀(ABI7500 Applied Biosystems)。

1.3 模型制備

參照《肺臟免疫學(xué)及免疫相關(guān)性疾病》[8]造模方法，建立大鼠哮喘模型。

在實驗的第1天和第8天分別對各組大鼠以10%的卵蛋白溶液進(jìn)行腹腔注射1 mL，空白組用0.9%生理鹽水代替，進(jìn)行致敏。在實驗第15天取1%的卵蛋白溶液由超聲霧化器霧化20 min，進(jìn)行激發(fā)，每日1次，連續(xù)激發(fā)7 d。以大鼠出現(xiàn)呼吸急促喘息，節(jié)律加快或不齊，反應(yīng)遲鈍，毛色失去光澤，大便不調(diào)為造模成功。

1.4 治療方法

針刺組：從實驗第15天起，選用一次性毫針(0.30 mm×13 mm)，“肺俞”(雙)直刺6 mm，“大椎”直刺5 mm，“風(fēng)門”(雙)直刺6 mm，三穴均采用平補(bǔ)平瀉法，每次留針20 min，留針期間每10 min行針1次，起針后激發(fā)，每天1次，共針刺7次。穴位定位參照《實驗針灸學(xué)》。

艾灸組:從實驗第15天起，將艾條點燃后，在距離“肺俞”(雙)皮膚上方2～3 cm施行溫和灸、在距離“大椎”“風(fēng)門”(雙)皮膚上方2～3 cm施行回旋灸，每次灸10 min，每天灸1次，灸畢進(jìn)行激發(fā)，共灸7次。

空白組和模型組：不做任何治療，只給予如針刺、艾灸組相同抓握刺激。

1.5 標(biāo)本取材

末次激發(fā)24 h內(nèi)大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)，待大鼠麻醉后，打開腹腔，取腹主動脈血5 mL，以3 000 r/min，離心30 min,取上層血清，-20 ℃冰箱保存,ELISA待測。

打開胸腔暴露肺及心臟，即刻取右肺中下葉(包括肺門)，用4 ℃生理鹽水將其漂洗干凈后，立即放入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，用石蠟包埋，肺組織病理切片待測。

取右肺下葉組織，黃豆粒大小，用4 ℃生理鹽水漂洗血跡，放入DEPC處理過的2 mL凍存管內(nèi)，投入液氮罐保存，RT-PCR待測。

1.6 指標(biāo)檢測

切片肺組織進(jìn)行HE染色；IL-13進(jìn)行ELISA檢測；STAT6進(jìn)行RT-PCR檢測，操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為和體征

空白組：大鼠呼吸平穩(wěn)，反應(yīng)靈敏，毛色光澤，飲食、二便正常。模型組：激發(fā)后大鼠呼吸急促、喘息、抓耳撓腮，連續(xù)激發(fā)后毛色干枯、脫落，反應(yīng)遲鈍，行動遲緩，飲食減少，大便不調(diào)。針刺組和艾灸組：經(jīng)過針灸治療，大鼠呼吸急促、喘息、抓耳撓腮癥狀明顯減輕，毛色光澤度較好，行動較前靈敏，飲食較前增加，二便趨于正常。

2.2 HE染色結(jié)果

空白組大鼠支氣管管腔規(guī)整，黏膜無明顯水腫，未見到淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤。模型組大鼠肺組織中可見支氣管管壁及平滑肌增厚、管腔狹窄，可見大量的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤。艾灸組大鼠支氣管管腔基本規(guī)整，基底膜稍有增厚，可見少量炎性細(xì)胞的浸潤。針刺組大鼠支氣管管腔基本正常，基底膜稍有增厚，偶見嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。具體見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果(×400)

2.3 血清IL-13含量表達(dá)

空白組大鼠血清中IL-13表達(dá)量很少;模型組大鼠IL-13表達(dá)較多，與空白組比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;針刺組和艾灸組大鼠血清中IL-13表達(dá)量明顯減少，與模型組相比P<0.05，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;針刺組與艾灸組相比P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中IL-13含量表達(dá)比較

2.4 肺組織STAT6 mRNA表達(dá)

空白組大鼠肺組織中STAT6 mRNA表達(dá)量很少;模型組大鼠STAT6 mRNA表達(dá)較多，與空白組比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；針刺組和艾灸組大鼠肺組織STAT6 mRNA表達(dá)量明顯減少，與模型組相比P<0.05，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;針刺組與艾灸組相比P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肺組織STAT6 mRNA表達(dá)的比較

3 討論

哮喘是由多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥性疾病，其中Th1與Th2的失衡是哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[3]。Th2炎癥因子的異常表達(dá)在哮喘發(fā)病中起重要作用，Th2可分泌多種白介素，如IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，促進(jìn)肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞生長和分化，誘導(dǎo)哮喘發(fā)作[9]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，哮喘的病因包括六淫侵襲機(jī)體的外因和飲食、勞倦、七情內(nèi)傷等的內(nèi)因。病機(jī)包括痰飲內(nèi)伏、外邪侵襲、氣滯血瘀等邪實及肺、脾、腎三臟機(jī)能衰退等正虛兩個方面。肺俞屬足太陽膀胱經(jīng)，內(nèi)應(yīng)肺臟，是肺臟精氣輸注于背部的腧穴，《素問·咳論》曰：“治臟者，治其俞”，具有調(diào)理肺氣、止咳平喘，祛風(fēng)邪、實腠理之功。邵經(jīng)明教授通過對肺俞、大椎、風(fēng)門三穴正交實驗[10]，證實肺俞穴平喘效果最佳。大椎又名“諸陽之會”，為督脈穴，可通上達(dá)下，宣通一身之陽氣，通調(diào)振奮督陽，有疏風(fēng)解表、通陽散寒、宣肺降逆、理氣平喘之功。風(fēng)門屬足太陽膀胱經(jīng)，為外邪侵襲人體之門戶，針之有疏散風(fēng)寒、清瀉邪熱、調(diào)理肺氣、止咳平喘、實腠固表之效。三穴同用，發(fā)作期能夠降低氣道阻力，有理肺降逆、止咳平喘之效；緩解期能夠改善肺功能，益肺固衛(wèi)，增強(qiáng)體質(zhì)，預(yù)防發(fā)作，鞏固遠(yuǎn)期療效。

白介素-13(IL-13)是一個具有代表性的Th2型細(xì)胞因子,被認(rèn)為是哮喘發(fā)病中最重要的細(xì)胞因子之一。具有介導(dǎo)Th2應(yīng)答的功能，在支氣管哮喘T細(xì)胞免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。IL-13能夠不依賴于IgE和嗜酸粒細(xì)胞而單獨誘導(dǎo)產(chǎn)生過敏性哮喘的病理生理改變，IL-13還可抑制Eos、B淋巴細(xì)胞的凋亡,從而使氣道炎癥的持續(xù)時間延長[11]。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activatorof transcription，STAT)6是Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)Th2分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子[12]。通過JAK/STAT信號通路介導(dǎo)IL-4、IL-5、IL-13誘導(dǎo)的基因表達(dá)，促進(jìn)IgE生成，導(dǎo)致哮喘發(fā)作[13]。STAT6的持續(xù)活化和過度表達(dá)會促進(jìn)Th2的募集、增殖及Th2型細(xì)胞IL-4、IL-13的優(yōu)勢表達(dá)，從而導(dǎo)致Th1/Th2的失衡，而IL-13能誘導(dǎo)STAT6激活，從而趨化EOS等細(xì)胞向炎癥部位聚集，引起氣道炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性[14]。

本實驗研究觀察血清中IL-13及肺組織中STAT6的表達(dá)變化影響，結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中IL-13及肺組織中STAT的表達(dá)明顯高于空白組，提示IL-13及STAT6與哮喘的氣道炎癥的發(fā)生具有內(nèi)在聯(lián)系，針刺組及艾灸組大鼠血清中IL-13及肺組織中STAT6的表達(dá)明顯降低，說明針刺、艾灸治療均可以改善哮喘模型大鼠肺組織的炎癥浸潤狀態(tài)以及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。說明針灸“肺俞”“大椎”“風(fēng)門”能明顯降低哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺組織中STAT6的陽性表達(dá)，有效改善氣道炎癥，這可能是針灸改善哮喘癥狀，治療哮喘的作用機(jī)制之一。