龐欣欣，石秀杰，彭紫凝，張雅歌，邢玉鳳，韓佳瑞*

(1.河南省中醫(yī)院，河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是一種自身免疫性疾病，是僅次于IgA腎病的第二大原發(fā)性腎小球疾病[1]，約占成人原發(fā)性腎病綜合征的1/3[2]。MN主要病理特征為腎小球基底膜免疫復(fù)合物沉積及基底膜增厚，臨床起病隱匿，約有50%～75%大量蛋白尿的MN患者在10年內(nèi)會(huì)發(fā)展為終末期腎臟病或者慢性腎臟病[3]。MN患者常常處于高凝狀態(tài)，研究表明，高達(dá)1/3的MN患者會(huì)出現(xiàn)血栓風(fēng)險(xiǎn)[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)MN患者高凝狀態(tài)的防治主要采用肝素、低分子肝素、華法林等藥物，雖然有一定的療效，但長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致出血、肝腎功能損害等不良反應(yīng)。

中醫(yī)藥在MN的治療中取得了許多成果，具有多靶點(diǎn)、個(gè)體針對(duì)性強(qiáng)、整體調(diào)節(jié)等優(yōu)勢(shì)[5]，愈來(lái)愈受到臨床重視。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為MN屬于“水腫”“尿濁”范疇，MN的高凝狀態(tài)屬于“瘀血證”范疇，治療上多采用活血化瘀類(lèi)中藥防治血栓和栓塞的形成與發(fā)展。紅花是臨床常用的活血化瘀中藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示其具有抗凝、改善腎微循環(huán)、降脂、保護(hù)免疫功能等作用[6]，常配伍或單獨(dú)應(yīng)用于MN的臨床治療，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘紅花治療膜性腎病的有效成分及作用機(jī)制，同時(shí)構(gòu)建紅花有效作用靶點(diǎn)與膜性腎病疾病靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，探索紅花治療膜性腎病的靶點(diǎn)。并進(jìn)一步對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行疾病-藥物-分子-靶點(diǎn)互相作用的可視化分析、GO和KEGG富集分析，從而為紅花治療膜性腎病的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 紅花有效成分篩選

通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)[7](Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)挖掘紅花的所有化學(xué)成分，根據(jù)各個(gè)成分的吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)，即ADME參數(shù)篩選有效成分，其中篩選條件為藥物口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug like，DL)≥0.18。

1.2 紅花的作用靶點(diǎn)和MN的相關(guān)靶點(diǎn)檢索

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以“CarthamiFlos”為關(guān)鍵詞，預(yù)測(cè)篩選紅花有效成分作用靶點(diǎn)。以“Membranous nephropathy”為關(guān)鍵詞在GeneCards[8]、DrugBank[9]、DisGeNET[10]、GAD等數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選所有與MN有關(guān)的所有靶點(diǎn)。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

String數(shù)據(jù)庫(kù)可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建紅花作用靶點(diǎn)與MN靶點(diǎn)的交集PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選核心靶點(diǎn)。篩選參數(shù)設(shè)置主要有：生物機(jī)體選擇為人類(lèi)，最低要求交互分?jǐn)?shù)設(shè)置最高置信度0.4。

1.4 紅花治療MN網(wǎng)絡(luò)調(diào)控可視化

基于紅花和MN的蛋白互作靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，引入紅花可作用于MN的有效成分，采用Cytoscape 3.7.2軟件把這些數(shù)據(jù)繪制成為可視化網(wǎng)絡(luò)圖。其中“圓形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“邊”表示不同成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系，挖掘其相互之間的作用關(guān)系。即得到紅花治療MN的疾病-藥物-分子-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO和KEGG富集分析

DAVID(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫(kù)廣泛應(yīng)用于基因注釋?zhuān)赏ㄟ^(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘基因與疾病的相關(guān)性。通過(guò)DAVID工具對(duì)紅花和MN交集蛋白靶標(biāo)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，得到紅花治療MN潛在靶點(diǎn)可能具有的生物學(xué)功能以及主要作用通路。校正統(tǒng)計(jì)學(xué)超幾何分布定量(P.adjust值)來(lái)評(píng)估存在于各GO和KEGG注釋中的蛋白生物學(xué)功能和通路富集情況的顯著性，P.adjust值在圖中顏色越紅，則顯著性越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 紅花有效成分ADME分析

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中紅花所有成分，按照OB≥30%和DL≥0.18進(jìn)一步篩選出紅花有效成分22個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 紅花有效成分ADME分析結(jié)果

2.2 紅花的作用靶點(diǎn)和MN的相關(guān)靶點(diǎn)檢索結(jié)果

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查找到22個(gè)紅花的有效成分中，只有18個(gè)有效成分具有相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，對(duì)這18個(gè)有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)基因注釋?zhuān)瑒h去不具有基因名稱(chēng)以及重復(fù)靶點(diǎn)，得到187個(gè)有效預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)。在GeneCards、DrugBank、DisGeNET、GAD等數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選MN相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，共得到3 191個(gè)與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。取紅花和MN的有效靶點(diǎn)交集，得到128個(gè)共同靶基因，見(jiàn)圖1。

圖1 紅花活性成分有效靶基因與MN相關(guān)靶基因

2.3 紅花-MN作用靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系分析

取紅花活性成分有效靶基因與MN相關(guān)靶基因的相互作用的128個(gè)靶點(diǎn)，采用String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，得到2 384條PPI關(guān)系，見(jiàn)圖2。取其中富集節(jié)點(diǎn)數(shù)目最多的前30個(gè)靶點(diǎn)，做出柱狀圖，得到前30個(gè)紅花-MN核心靶點(diǎn),核心靶點(diǎn)圖見(jiàn)圖3，主要有蛋白激酶、白蛋白、炎癥因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子等。

注：黃色：蛋白互作關(guān)系;黑色：基因共表達(dá)的關(guān)系;淺藍(lán)色：蛋白同源性;深藍(lán)色：基因共進(jìn)化;紅色：基因融合;綠色：基因臨接。

注：橫軸為富集節(jié)點(diǎn)數(shù)目，縱軸為靶點(diǎn)基因名稱(chēng)。

2.4 紅花治療MN網(wǎng)絡(luò)可視化分析

通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行紅花治療MN的網(wǎng)絡(luò)的疾病-藥物-分子-靶點(diǎn)互相作用的可視化分析。納入上述PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的128個(gè)基因和分析篩選得到16個(gè)紅花可用有效成分，同時(shí)在網(wǎng)絡(luò)中加入疾病和藥物使網(wǎng)絡(luò)圖更加直觀。網(wǎng)絡(luò)可視化圖見(jiàn)圖4。

注：六邊形代表紅花，菱形代表MN，三角形代表紅花16個(gè)有效作用成分，圓形代表紅花作用于MN的128個(gè)靶點(diǎn)。其中A代表4-[(E)-4-(3,5-dimethoxy-4-oxo-1-cyclohexa-2,5-dienylidene)but-2-enylidene]-2,6-dimethoxycyclohexa-2,5-dien-1-one；B代表7,8-dimethyl-1H-pyrimido[5,6-g]quinoxaline-2,4-dione；C代表poriferast-5-en-3beta-ol。

2.5 紅花治療MN的機(jī)制分析

通過(guò)DAVID工具對(duì)紅花和MN交集蛋白靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO和KEGG分析，具體得到紅花可治療MN的作用靶點(diǎn)的生物學(xué)功能142種，綜合分析后取前20種功能特性，得到紅花有效成分靶點(diǎn)主要通過(guò)如DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ型特異性、細(xì)胞因子受體結(jié)合性、受體配體活性、細(xì)胞因子活性等治療MN，見(jiàn)圖5。得到紅花治療MN信號(hào)通路有158條，綜合分析后取前20條信號(hào)通路。KEGG分析顯示，紅花治療MN的有效靶點(diǎn)主要在晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)-受體(receptor of AGEs，RAGE)信號(hào)通路、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atheroscierosis)、乙型肝炎(Hepatitis B)、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路等，見(jiàn)圖6。其中氣泡或柱形圖顏色越紅，則校正P值越高，顯著性越強(qiáng)，氣泡大小越大或柱形越長(zhǎng)，則該生物學(xué)功能或該通路富集的靶點(diǎn)越多。根據(jù)排名，找到這些靶點(diǎn)最關(guān)鍵的AGEs-RAGE信號(hào)通路圖，同時(shí)用紅色表示紅花靶點(diǎn)在該信號(hào)通路上具體作用點(diǎn)，見(jiàn)圖7(所有結(jié)果均符合P.adjust<0.05)。

3 討論

近年來(lái),我國(guó)膜性腎病的發(fā)病率持續(xù)上升,已由12%增長(zhǎng)至50%[11]，具有病程反復(fù)、慢性遷延等特點(diǎn)，若得不到及時(shí)治療可引起血栓栓塞、心血管事件風(fēng)險(xiǎn)、腎功能衰竭等并發(fā)癥形成，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及預(yù)后。靜脈血栓栓塞是MN患者常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥，其導(dǎo)致的年死亡率高達(dá)10%[12]。靜脈血栓栓塞臨床多表現(xiàn)為無(wú)癥狀，且尚未形成血栓的MN患者是否進(jìn)行抗凝治療目前仍存在爭(zhēng)議，因此常常影響治療時(shí)機(jī)。

中醫(yī)藥治療MN療效肯定，在改善腎功能、減輕臨床癥狀的同時(shí)，還可以減輕西藥不良反應(yīng)[13]。根據(jù)MN的臨床癥狀，可將其歸屬于“水腫”“尿濁”“虛勞”等范疇。許多中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為瘀血是MN的主要病機(jī)之一，臨床常配伍應(yīng)用活血化瘀藥。鄧躍毅教授提出MN患者體內(nèi)沉積的免疫復(fù)合物以及大劑量激素治療可成為損傷機(jī)體的“藥毒”，認(rèn)為膜性腎病患者常為“瘀毒共生”，主張活血、通絡(luò)之法應(yīng)當(dāng)貫穿MN的治療始終[14]。趙玉庸教授認(rèn)為“腎絡(luò)瘀阻”是MN的基本病機(jī)，臨床擅用蟲(chóng)類(lèi)藥通腎絡(luò)治療MN，收效甚佳[15]。紅花性辛溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血化瘀的功效，是臨床常用的活血化瘀類(lèi)中藥[16]。紅花在治療MN中常被單獨(dú)或者配伍應(yīng)用，不僅可以改善MN常見(jiàn)的高凝狀態(tài)，而且對(duì)蛋白尿也有良好的治療效果[17]。目前紅花治療MN的機(jī)制尚不清楚，陳文軍等[18]研究表明,紅花黃色素注射液能夠降低MN大鼠蛋白尿、改善血脂代謝并提高血漿蛋白水平，其機(jī)制可能與下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)有關(guān)。

注：“count”值代表與該生物學(xué)功能相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)量;P.adjust表示顯著性。

注：橫軸代表在該信號(hào)通路上的靶點(diǎn)數(shù)量;P.adjust表示顯著性。

注：紅色表示紅花在信號(hào)通路上的作用靶點(diǎn)(原圖來(lái)源于KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù))。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)地預(yù)測(cè)了紅花治療MN的潛在分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其具有多通路、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。本研究篩選紅花的有效成分22個(gè)，模擬預(yù)測(cè)187個(gè)有效預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)和3 191個(gè)與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，取紅花和MN的有效靶點(diǎn)交集，得到128個(gè)共同靶基因，“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，紅花作用于MN的核心靶點(diǎn)主要有蛋白激酶1(AKT1)、白蛋白(ALB)、炎癥因子白介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3等，通過(guò)對(duì)以上核心靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)紅花主要通過(guò)以下這些生物學(xué)功能特性治療MN，如DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合性、受體配體活動(dòng)、細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ型特異性等。

本研究進(jìn)一步針對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示，紅花治療MN主要通過(guò)影響AGEs-RAGE信號(hào)通路、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎。其中AGEs-RAGE信號(hào)通路為關(guān)鍵通路。AGEs-RAGE信號(hào)通路激活蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)，一方面PKC可以刺激下游細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)、JNK通路、AKT通路，導(dǎo)致激活蛋白-1(AP-1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路激活，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、細(xì)胞黏附分子、炎癥因子等的大量釋放，導(dǎo)致機(jī)體損傷[19-20]。另一方面，PKC通路可激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)通路，刺激JNK通路，抑制凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)凋亡因子Bax(Bcl-2-associated X protein)蛋白表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。因此，紅花可作用于AGEs-RAGE下游通路中的多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究揭示了紅花可能主要通過(guò)抗炎、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成等發(fā)揮對(duì)MN的治療作用。但本研究還存在以下局限性：1)紅花單獨(dú)用于MN的臨床或?qū)嶒?yàn)研究較少，主要通過(guò)與其他藥物配伍來(lái)治療MN，因此未來(lái)還可以探索紅花與其他藥物相互作用治療MN的靶點(diǎn)及作用機(jī)制；2)目前紅花對(duì)MN的研究部分使用注射液，因此本研究采用口服利用度來(lái)篩選紅花有效成分具有一定的局限性；3)本文研究結(jié)果主要通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)紅花作用于MN靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，今后還需進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。