凌爽，畢悅，李孟，牛雯穎，肖洪彬，馮月男

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血瘀證是因氣滯、氣虛、寒凝、火熱等因素，導(dǎo)致血行不暢，或因外傷、各種急性、慢性病導(dǎo)致出血未消散者。氣虛血瘀證是中醫(yī)臨床的常見證型，也是臨床中多個學(xué)科、多種疾病的常見證候，其在心腦血管疾病、腎臟疾病及老年病中更為常見。目前對氣虛血瘀證發(fā)病機(jī)理的現(xiàn)代研究主要集中在血液流變學(xué)及血流動力學(xué)異常、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性物質(zhì)的失衡、促凝血因子增加、抗凝血因子及纖溶活性物質(zhì)減少等。臨床研究也證明，氣虛血瘀證患者均有不同程度的全血黏度及血漿黏度增高、紅細(xì)胞聚集增加、紅細(xì)胞變形指數(shù)降低等[1-6]。補陽還五湯是臨床活血化瘀的經(jīng)典方，運用了大量的補氣藥和多味活血藥進(jìn)行配伍，是以氣虛血瘀為基本病機(jī)的疾病代表名方，受到醫(yī)家重視而沿用至今。本實驗主要側(cè)重于研究補陽還五湯對于氣虛血瘀型大鼠的血液流變學(xué)及紅細(xì)胞相關(guān)指數(shù)的影響，為臨床治療氣虛血瘀證候的相關(guān)疾病提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級健康的SD大鼠40只，雌、雄各半，體質(zhì)量200～220 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。動物許可證號:SYXK(黑)2016-004。所有動物飼養(yǎng)于20～22 ℃的室內(nèi)，自由攝食飲水。

1.2 實驗藥物

補陽還五湯組方：黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍5 g，地龍3 g，桃仁3 g，川芎3 g和紅花3 g。上述實驗中所需要的中藥飲片均嚴(yán)格遵守《中華人民共和國藥典》(2015年版)中規(guī)定的科、屬、種，均在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院采購。

1.3 主要儀器

全自動血液流變儀(型號：LBY-N7500B，北京普利生儀器有限公司)；全自動血液細(xì)胞分析儀(型號：X500，日本希森美康有限公司)；高速臺式離心機(jī)(型號：TGL-16G，蘇州捷美電子有限公司)；全自動血凝儀(型號：C2000-A，北京普利生儀器有限公司)。

1.4 實驗試劑

凝血酶原時間 (prothrombin time，PT)試劑盒(批號：1812126)、凝血酶時間(thrombin time，TT)試劑盒(批號：1801007)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)試劑盒(批號：1812009)、纖維蛋白原(Human Fibrinogen，F(xiàn)IB)試劑盒(批號：1804041)均來自于上海長島生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 模型制備及給藥方法

40只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，分別為空白組、模型組和補陽還五湯高、低劑量組。每組大鼠10只，全部正常飲水?dāng)z食，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。各組大鼠以5%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，大鼠麻醉成功后將其置于仰臥位，四肢與頭部固定于老鼠固定板上，模型組及給藥組采用氣管插管的方式將注射博萊霉素生理鹽水溶液(7 mg/kg)一次性經(jīng)由氣管內(nèi)完成注射，空白組給予同體積生理鹽水。完成注射后隨即將大鼠直立旋轉(zhuǎn)，使藥液在其肺內(nèi)均勻分布。結(jié)束等待大鼠清醒后，將其放回籠中正常喂養(yǎng)。造模14 d后，開始進(jìn)行灌胃給藥，空白組、模型組予等體積生理鹽水，補陽還五湯高、低劑量組予相應(yīng)藥物(1 mL/100 g)，連續(xù)進(jìn)行21 d灌胃治療。治療期間全部大鼠均自由進(jìn)水，予普通的生長飼料喂養(yǎng)。

2.2 取血

取血前大鼠禁食12 h，但不禁水，末次給藥1 h后腹腔注射5%水合氯醛5 mL/kg進(jìn)行麻醉，將大鼠仰臥于手術(shù)臺上腹主動脈采血，然后檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 血液流變學(xué)指標(biāo)檢測

取肝素鈉抗凝血4 mL，進(jìn)行全血黏度的測定。剪切參數(shù)分別設(shè)為低、中和高切變率，用血液流變儀測定全血黏度。

取枸櫞酸鈉抗凝血2 mL，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層血漿，利用全自動血液流變儀測定血漿黏度。

2.3.2 紅細(xì)胞壓積、聚集、剛性、變形指數(shù)測定

取EDTA-K2抗凝血2 mL，利用全自動血液細(xì)胞分析儀，測定紅細(xì)胞壓積、聚集、剛性及變形指數(shù)相關(guān)參數(shù)指標(biāo)。

2.3.3 凝血四項測定方法

取枸櫞酸鈉抗凝血2 mL，3 000 r/min離心10 min得到血漿，按試劑盒的說明書操作，利用全自動血凝儀測定凝血四項FIB、PT、TT和APTT值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 補陽還五湯對大鼠全血黏度、血漿黏度的影響

與空白組比較，模型組在低、中切變率下全血黏度極顯著上升(P<0.01)、高切變率下全血黏度顯著上升(P<0.05)，血漿黏度顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯高劑量組高、中、低切變率下的全血黏度及血漿黏度均顯著下降(P<0.05)；補陽還五湯低劑量組高、中、低切變率下的全血黏度及血漿黏度均顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 補陽還五湯對大鼠全血黏度、血漿黏度的影響

3.2 補陽還五湯對大鼠紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的影響

與空白組比較，模型組RBC壓積、RBC聚集指數(shù)、RBC剛性指數(shù)顯著升高(P<0.05)，RBC變形指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯高、低劑量組RBC壓積、RBC聚集指數(shù)、RBC剛性指數(shù)顯著降低(P<0.05)，紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 補陽還五湯對大鼠紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的影響

3.3 補陽還五湯對大鼠凝血功能的影響

與空白組比較，模型組的APTT、TT、PT時間顯著縮短(P<0.05)，F(xiàn)IB含量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯高、低劑量組APTT、TT、PT時間顯著延長(P<0.05)，同時顯著降低了FIB含量(P<0.05)。見表3。

表3 補陽還五湯對大鼠凝血功能的影響

4 討論

補陽還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，有補氣活血通絡(luò)之功效，主治氣虛血瘀之中風(fēng)。補陽還五湯可以廣泛用于臨床各科疾病的治療，主要以腦缺血、腦梗死、糖尿病等為主[7-14]。血液黏度增高是氣虛血瘀證的主要表現(xiàn)之一，多種因素均可以影響血液黏度，其中紅細(xì)胞自身的變形性和聚集性的改變是其發(fā)生變化的主要因素。而用來衡量血液黏滯程度的一項重要指標(biāo)就是全血黏度。全血黏度從切變率上分為高、中、低切3個不同程度，而對全血黏度產(chǎn)生影響的因素又包括紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集性、變形能力以及血漿的黏稠程度等。在高切變率下的全血黏度主要由紅細(xì)胞的變形性決定，在該切變率下的血液黏度越高，說明紅細(xì)胞的變形能力或彈性越差；而在低切變率的條件下，全血黏度主要反映的是紅細(xì)胞聚集性，其全血黏度越高，表明紅細(xì)胞聚集性越高。全血黏度的變化在血栓性疾病的診斷、治療以及預(yù)防方面起著十分重要的作用。血漿黏度是反應(yīng)血液黏滯程度的又一項重要指標(biāo)，而影響血漿黏度的重要指標(biāo)之一就是纖維蛋白原。凝血酶原時間(PT)是評價外源性凝血系統(tǒng)較為敏感和常用的試驗參數(shù)，它的變化主要反映凝血因子和纖維蛋白原的血漿水平的改變；活化部分凝血活酶時間及凝血酶時間的延長與內(nèi)源系統(tǒng)的凝血酶的抑制有關(guān)；纖維蛋白原(FIB)通過凝血酶作用可以直接破壞內(nèi)皮細(xì)胞，使其在血液中發(fā)生遷移，變性，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增生、肥大，最終形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使血液黏度增高[15-17]。

本研究中，與空白組比較，模型組大鼠的全血黏度在高、中、低3個切變率下均顯著升高，血漿黏度也發(fā)生明顯的異常改變，同時，紅細(xì)胞壓積增大、紅細(xì)胞聚集力增強、紅細(xì)胞剛性增強以及紅細(xì)胞變形性出現(xiàn)下降；FIB、APTT、TT、PT均出現(xiàn)不同程度的病理改變，說明氣虛血瘀模型血液黏度升高。與模型組比較，補陽還五湯高、低劑量組均能夠顯著降低各切變率下的全血黏度，對血漿黏度、紅細(xì)胞聚集性、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞變形性以及凝血四項均有不同程度的改善作用。說明補陽還五湯可通過降低纖維蛋白原的含量、抑制凝血因子活性等途徑抑制內(nèi)、外源性凝血途徑的激活，通過激活凝血酶原、促進(jìn)凝血酶原激活物的生成、抑制凝血酶原激活物抑制物的釋放等途徑增強纖溶活性，改善血液瘀滯狀態(tài)。這一研究結(jié)果對于臨床治療氣虛血瘀證，改善血液濃、黏、凝、聚狀態(tài)具有一定的臨床指導(dǎo)意義。