楊 欽，王天星，楊軼雄，馬明楊，陳其兵，呂兵洋，江明艷

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都 611130）

森林作為最重要的陸地生態(tài)系統(tǒng)，有著很重要的生態(tài)服務(wù)和保健功能，隨著城市生活節(jié)奏的加快，人們越來越渴望到森林中進行減壓放松，健身康體[1]。已有研究報道，森林環(huán)境可以降低焦慮和壓力水平[2-3]，顯著改善抑郁癥狀[4-5]，具有抗高血壓作用[6-7]等，這些都與吸入森林環(huán)境中的生物揮發(fā)性有機化合物（BVOCs）有著重要關(guān)系[8-9]，因為森林中植物釋放的BVOCs可以提升空氣質(zhì)量并且引起人和動物愉悅和舒適的感覺[10]，也有一些芳香味的BVOCs可以降低血壓和改善情緒[11-12]。這些植物從花到根的所有器官都可以釋放BVOCs[13]，其中葉片通過氣孔向大氣中釋放BVOCs并且排放率最高[14]。植物BVOCs的釋放具有動態(tài)變化，日變化規(guī)律一般為白天高晚上低，并且白天呈上升趨勢[15]，同時季節(jié)變化顯著，一般而言夏季BVOCs總濃度最高，春季次之[16-17]。頂空固相微萃取是目前植物活體BVOCs的常見收集方法[18]，它是一種不用有機溶劑的新型萃取技術(shù)，集采集、萃取、富集、進樣于一體，具有靈敏度高、操作簡單和綠色環(huán)保的特點。而分析植物有機揮發(fā)物最有效的方法是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），可以對樣品中全部或指定成分作定性和定量分析[19]。

竹林是森林的重要組成部分，全世界竹林面積占了森林面積的3.9%左右，而亞太竹區(qū)為世界最大竹類植物分布區(qū)，約占世界竹林總面積的64%[20]，其中中國是亞太竹區(qū)最主要的竹資源分布國家之一[21]。近年來，竹林旅游越來越受到人們的關(guān)注，國內(nèi)學(xué)者對竹林旅游的研究主要集中在竹文化旅游[22]，竹林生態(tài)旅游[23]以及竹林養(yǎng)生旅游[24]的開發(fā)模式上，而對竹類植物自身的BVOCs含量成分及其對人體的保健功能的研究較少，目前大中型竹種主要有毛竹[25-27]、紫竹[28]、雷竹[29]、剛竹[30]和苦竹[31]等被研究，并且集中在萜類化合物和異戊二烯的排放規(guī)律上。本項研究采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法（HSSPME-GC-MS），檢測了中國開發(fā)利用較充分的8種竹子BVOCs相對含量以及排放種類，并對各竹種間的BVOCs的差異進行比較分析。

1 材料和方法

1.1 風(fēng)景竹林竹葉BVOCs成分分析

四川省位于中國的西南地區(qū)，是中國的混生竹區(qū)，具有竹種資源豐富并且適合于多種竹種生長的氣候特點。位于四川省成都市的望江樓公園（30°37′N，104°05′E）是著名的竹種園，全園收集了 400多種竹子，其中包括在中國大面積分布的大中型風(fēng)景竹林竹種。因此在望江樓公園中于2019年8月中旬晴朗無風(fēng)的天氣采集8種大中型竹種（斑竹、紫竹、硬頭黃竹、慈竹、梁山慈竹、雷竹、苦竹和吊絲球竹）的健康無損傷葉片50 g，4℃儲存運輸?shù)綄嶒炇伊⒓催M行檢測。每個竹種的受測葉片均由5株2 a生竹的向陽背風(fēng)面上、中、下部的葉片均勻混合所得。

對在上述研究地采集到的每種竹葉剪碎并混合均勻，分別稱取2 g放置于20 mL頂空萃取瓶中，密封，靜置30 min。將型號為50/30 μm DVB/CAR/PDMS（美國Supelco公司）的纖維頭通過聚四氟乙烯瓶墊插入到萃取瓶中，置于樣品正上方0.5 cm左右，60℃水浴中頂空萃取45 min。然后將纖維頭插入QP2010PLUS氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津）的GC進樣口，解吸10 min，同時吸附空萃取瓶中的氣體作為空白對照。每種竹葉重復(fù)3次。正構(gòu)烷烴標準品購自Sigma-Aldrich中國公司。

色譜條件：色譜柱為RXi-5ms石英毛細管柱氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。分流比 3∶1；進樣口270℃；載氣為高純He氣；柱溫箱升溫程序：40℃保持5 min，然后5℃/min升溫到120℃保持2 min，然后10℃/min升溫到280℃保持3 min；吹掃流量：5 mL/min。質(zhì)譜條件：離子源為EI（electron ionsizations）；電離能 70 eV；輔助加熱區(qū) 280 ℃；離子源200℃；接口溫度為220℃；采集模式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍（m/z）33～500；溶劑延遲 0.1 min。

取正構(gòu)烷烴混合標準樣品C5-C8，C8-C20各1μL，按照上述同樣步驟分析，記錄各成分的保留時間，計算各成分的 LRI值（線性保留指數(shù)），其中，tx，tn和tn+1分別是待分析組分和碳原子數(shù)目處于n和n+1之間的組分（tn＜tx＜tn+1）的出峰保留時間。

進行GC-MS分析，采集所得到的總離子流色譜圖，利用NIST08.LIB譜庫對得到的質(zhì)譜圖進行串聯(lián)檢索，同時采用保留指數(shù)定性的方法和參考文獻方法來輔助質(zhì)譜檢索定性[32]。依據(jù)總離子流色譜峰的峰面積歸一法進行定量分析，計算各樣品組分的相對含量。

1.2 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2017和Origin 18.0整理數(shù)據(jù)并繪圖，使用PAST 3.0軟件計算Bray-Curtis相似性指數(shù)并繪制聚類分析圖與主成分分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種竹葉BVOCs組成和含量

通過GC-MS分析，扣除本底空氣中的雜質(zhì)，離子流色譜圖如圖1，并根據(jù)保留時間列出化合物。從夏季8種竹葉釋放的BVOCs中共鑒定出105種化合物（表 1），共有的 BVOCs有 20種：葉醇、2-己烯醛、芳樟醇、甲酸正己酯、1-辛烯-3-醇、3-己烯醛、3-辛酮、順-2-戊烯醇、3,5,5-三甲基己-2-烯、1-戊烯-3-醇、β-環(huán)檸檬醛、反式-2-己烯-1-醇、2-乙基己醇、2-己炔-1-醇、辛醇、異戊醇、壬醛、β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮、乙酸葉醇酯。

圖1 夏季8種竹葉BVOCs色譜圖Figure 1 Total ionic chromatogram of BVOCs in leaves of eight bamboo species in summer

從鑒定的化合物種類來看（見表1，表2），斑竹（58種）＞苦竹（56種）＞紫竹（53種）=雷竹（53種）=慈竹（53種分）＞吊絲球竹（50種）＞梁山慈竹（48種）=硬頭黃竹（48種）。并且8種竹葉化合物種類主要為醇類，醛類和酯類，這3種類型的化合物的平均值分別為58.61%，21.21%和8.25%，占總化合物的88.07%。從圖1和表1可以發(fā)現(xiàn)8種竹葉的BVOCs中葉醇是含量最多的化合物，平均占總BVOCs的38.89%，其中雷竹（48.99%）＞苦竹（47.77%）＞紫竹（42.38%）＞吊絲球竹（40.43%）＞硬頭黃竹（37.06%）＞斑竹（36.76%）＞梁山慈竹（34.21%）＞慈竹（23.50%）。6個竹種的BVOCs含量第二的是2-己烯醛，分別為吊絲球竹（24.71%）＞苦竹（20.66%）＞紫竹（18%）＞慈竹（16.67%）＞雷竹（16.65%）＞斑竹（10.73%），而梁山慈竹和硬頭黃竹BVOCs含量第二的分別為乙酸葉醇酯（11.32%）和1-辛烯-3-醇（10.35%）。在105種化合物中，特有化合物種類擁有最多的是斑竹（8種），分別為正戊醇 、（+）-環(huán)苜蓿烯、β-石竹烯、香樹烯、巴倫西亞橘烯、α-衣蘭油烯、（+）-γ-卡丁烯和正十三烷，占了總成分的4.35%，并且這些特有化合物主要集中在萜烯類。特有化合物擁有第二多的是慈竹（6種），為月桂烯、（E）-B-羅勒烯、庚醛、樟腦、2,5-辛二酮、5-甲基-1-己醇，這些特有成分占總BVOCs的0.78%。

表2 夏季8種竹葉BVOCs種類組成Table 2 Composition of BVOCs of eight kinds of bamboo leaves in summer

2.2 各竹種間BVOCs差異

Bray-Curtis相似性指數(shù)是用于對比兩個樣本相似性的統(tǒng)計數(shù)據(jù)[33]，表3可以得出8種竹葉Bray-Curtis相似性指數(shù)范圍為56.97%～88.46%，均值68.46%，說明不同竹種之間的BVOCs的組成和含量存在一定的相似性。但有些竹種之間相似性指數(shù)不高，如梁山慈竹和苦竹（56.97%），梁山慈竹與雷竹（57.48%）等，說明不同竹種的BVOCs也存在一定差異性，因此需要進一步分析。

表3 8種竹葉BVOCs的Bray-curtis相似性指數(shù)Table 3 Bray-curtis similarity index of BVOCs of eight kinds of bamboo leaves

對8種竹葉的揮發(fā)性成分組成進行聚類分析（圖2），硬頭黃竹和梁山慈竹共有的化合物有37種，并且主要化合物含量相似，特有成分較少，聚為一類；苦竹、雷竹和紫竹共有的化合物有40種，主要化合物含量相似，聚為一類；斑竹、吊絲球竹與苦竹、雷竹、紫竹的特異性成分有較大差異但含量不高，且這5個竹種共有的化合物有23種，主要化合物種類差異不大，因此可以聚為一個大類。由于慈竹所含有的特有成分較多，并且與其他竹種的主要成分存在較大的差異，因此慈竹歸為最特殊的一類。

圖2 8種竹葉BVOCs聚類分析Figure 2 Cluster analysis of BVOCs of eight kinds of bamboo leaves

為了確定主要的50種化合物（出現(xiàn)頻率≥80%）對8種竹葉BVOCs之間的差異貢獻，使用主成分分析（PCA）分析了50種化合物的數(shù)據(jù)，PCA的前3個組成部分解釋了54.51%，26.99%和10.38%的變異，即91.88%的組合方差（圖3）。通過PCA分析可以發(fā)現(xiàn)，在8種竹葉BVOCs中可以看出明顯差異。硬頭黃竹與梁山慈竹分布區(qū)域接近，為一種類型，主要BVOCs為葉醇、1-辛烯-3-醇、乙醇、乙酸葉醇酯、2-己烯醛；紫竹、苦竹和雷竹的分布區(qū)域接近，為一種類型，主要BVOCs為葉醇、2-己烯醛、3-己烯醛、甲酸正己酯、芳樟醇；吊絲球竹、斑竹的主要化合物含量與紫竹、苦竹、雷竹有一定差異，因此它們的分布區(qū)域與這3種竹種相距較遠；慈竹的分布區(qū)域最遠，為最特殊的一類型，主要BVOCs為葉醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2-己烯醛、甲酸正己酯。上述結(jié)果與圖2的結(jié)果是相似的，說明各竹種間BVOCs的差異性是由含量多的化合物來決定。

圖3 8種竹子竹葉BVOCs的主成分（PC1，PC2和PC3）分析圖Figure 3 Main components（PC1，PC2 and PC3）of BVOCs of eight kinds of bamboo leaves

3 討論與結(jié)論

本研究檢測出的8個竹種釋放的BVOCs有48到58種化合物，相較前人對白松（41種）[34]、油松（19種）、白皮松（21種）、檜柏（19種、紅皮云杉（17種）、雪松（21種）[35]等松柏植物以及毛竹（23～33種）[26，36]的研究而言，揮發(fā)性有機化合物含量普遍偏多，這可能是因為使用的方法不同，前人對揮發(fā)性有機化合物的檢測多用熱處理的方法，而本實驗使用的方法是頂空固相微萃取，因此可以檢測出更多類型的化合物，并且也說明竹類植物有較強的釋放BVOCs的能力。目前揮發(fā)性有機化合物的研究主要針對松柏類[34-35，37-38]以及花卉[39-41]，主要 BVOCs 是異戊二烯、萜類化合物、烷烴、酮類、酸類、醛類等。關(guān)于竹類植物的研究較少，其中毛竹排放的BVOCs主要為醇類、醚類與醛類[26，36]，紫竹BVOCs排放主要為異戊二烯、醇類、醛類等[29]，剛竹排放的BVOCs有醛類、烯類、醇類、酮類、酯類、萜類和酸類7類化合物[30]，苦竹主要為烷類和萜烯類[31]，巴山木竹、金佛山方竹、筇竹和峨眉箬竹竹葉主要釋放包括酯、醇、酸、醛、酮、萜烯烴類及少量酚類等成分[42]，而雷竹可以排放大量的異戊二烯[15]。本實驗中并未檢測出異戊二烯，這也與研究方法有關(guān)。前人用固相微萃取法檢測BVOCs的結(jié)果中異戊二烯的含量普遍較少[40-41]，這與本項研究結(jié)果一致。8種竹葉中釋放較多的BVOCs有葉醇、2-己烯醛、甲酸正己酯、1-辛烯-3-醇、3-己烯醛、芳香醇，其中葉醇、3-己烯醛和2-己烯醛具有青草氣味[43-44]，這三者混合在一起時可降低人腦的α-波的振幅值，從而減少人的壓抑感[45]，芳樟醇可以使心率減慢，讓緊張的情緒得到緩解[46]。此外，葉醇、壬醛、癸醛、1-辛醇、紫羅蘭酮、苯甲醛和苯乙醛等都具有良好的抗菌活性[35，47]，但是竹類植物不同化學(xué)成分之間涉及了復(fù)雜的協(xié)作機制，具體的保健功效還需進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，8種竹類植物的BVOCs中含量最高的都是葉醇，由于葉醇具有青草香氣，因此8種竹類植物均具有康養(yǎng)保健的潛力。但是，8種竹類植物的BVOCs也存在差異，這與O.Motonori等人指出12種竹類植物BVOCs的揮發(fā)性成分組成存在差異的研究結(jié)論相似[27]，說明了竹類植物BVOCs的復(fù)雜性與差異性。梁山慈竹和硬頭黃竹不僅葉醇含量較高，而且含有較多的乙酸葉醇酯和1-辛烯-3-醇，因此這兩個竹種相較于其他竹種更具有強烈的清香味[48-49]。慈竹則具有最多的特有成分，其中月桂烯具有令人愉快的甜香脂氣味，可興奮中樞[50-51]，且對肺黏液呼吸道阻塞的清除具有積極作用[52]；（E）-B-羅勒烯具有草香、花香味，并具有抗氧化和抗菌活性[53]，樟腦具有較強的抗氧化能力以及抑菌作用[54]，表明慈竹在BVOCs方面的康養(yǎng)保健效果有進一步挖掘和開發(fā)利用的可能性。雖然慈竹特有成分含量較低，但是可以通過栽培或遺傳調(diào)控措施的進一步研究，提高其特有的保健功能性BVOCs的含量，為竹林康養(yǎng)旅游開發(fā)提供理論和實踐支撐。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)8種竹葉BVOCs排放種類有105種，共有的BVOCs有20種，并且8種竹種相對含量最高的化合物都為具有青草香味的葉醇，均具有一定的保健功效。對8種竹種BVOCs的組成和含量進行聚類分析，可將其聚為3類，硬頭黃竹和梁山慈竹為一類，苦竹、雷竹、紫竹、斑竹和吊絲球竹為一類，慈竹為最特殊的一類。