萬 明，曹中贊，于 堃，盧立志，欒新紅

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所，浙江杭州 310000)

鴨疫里默氏菌病又叫鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥等，是由鴨疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的一種水禽急性或慢性接觸性傳染病。最初是在1904年Riemer報(bào)道了鴨疫里默氏菌感染鵝的情況，當(dāng)時(shí)稱之為“鵝滲出性敗血癥”，隨后德國學(xué)者Floren和Wiedeking等發(fā)現(xiàn)水禽都是該菌的易感動(dòng)物。Cooper G L等[1]發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏菌與火雞的脊髓炎有關(guān)，而且Charles S D[2]等發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏菌病會(huì)伴隨火雞新城疫的發(fā)生而出現(xiàn)。1988年，Hatfield R M和 Morris B A通過試驗(yàn)分別經(jīng)肌肉、口腔、鼻腔接種該菌，證明最佳投菌途徑是肌肉注射，這給日后做攻毒試驗(yàn)提供了理論依據(jù)[3]。1993年，Leavitt S等[4]從家鴨中分離出該菌，隨后該病在世界各地都有發(fā)生。在我國1982年郭玉璞等[5]首次報(bào)道了北京鴨場鴨疫里默氏菌感染情況。目前，國際上公認(rèn)該菌共有21個(gè)血清型，我國流行較多的是1型、2型和10型，其他血清型伴隨發(fā)生，各個(gè)血清型之間無交叉保護(hù)，因此給該病的免疫預(yù)防帶來很大的困難。目前治療該病的主要方法是藥物治療。但是隨著臨床藥物的使用，細(xì)菌的耐藥性和藥物殘留現(xiàn)象也隨之加重。Zhu D等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鴨疫里默氏菌具有獲得外來基因的能力，包括耐藥基因等。Li S等[7]發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏菌的RIA_1614基因可以增加其對(duì)鏈霉素和阿米卡星等氨基糖苷類藥物的抗性，同時(shí)可以提高其對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性。1993年，荷蘭學(xué)者DE等[8]使用疫苗很好地解決了農(nóng)場鴨疫里默氏菌病泛濫的問題。因此，疫苗的研制依然是控制該病的重要方法。本文就鴨疫里默氏菌病疫苗的應(yīng)用現(xiàn)狀和展望進(jìn)行綜述。

1 鴨疫里默氏菌病疫苗的應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 滅活疫苗

滅活疫苗一般是利用培養(yǎng)好的菌株，加熱或者用化學(xué)劑(福爾馬林等)將其滅活，即滅活疫苗可能由整個(gè)菌體或者病毒組成，也可能由它們的裂解片段組成。滅活疫苗是當(dāng)前預(yù)防和控制鴨疫里默氏菌病用的最多的疫苗，主要包括福爾馬林滅活苗、油乳劑滅活苗、氫氧化鋁膠滅活苗、蜂膠滅活苗和多價(jià)苗等。

1.1.1 福爾馬林滅活苗 早在1979年，學(xué)者E G Harry和J R Deb就開始研制福爾馬林滅活疫苗，隨后分別在實(shí)驗(yàn)室和野外對(duì)3周齡的雛鴨進(jìn)行免疫接種，取得了較好的免疫效果[9]。1979年-1984年間，英國和美國的一些學(xué)者也開始研制福爾馬林滅活疫苗并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室和野外試驗(yàn)，取得了比較滿意的臨床效果。1987年，張大丙等[5]從北京、廣東等病死鴨中分離得到血清1型鴨疫里默氏菌，研制出福爾馬林滅活苗和福爾馬林超聲滅活苗，分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室和野外試驗(yàn)。結(jié)果顯示，疫苗保護(hù)率在86.67%～100%，保護(hù)效果良好。

1.1.2 油乳劑滅活苗 1988年，德國學(xué)者Floren U等研究了油乳劑滅活疫苗，并做了免疫保護(hù)試驗(yàn)。隨后，高福等[10]試制鴨疫里默氏菌雙相油乳劑疫苗，首免8日齡雛鴨，22日齡攻毒，保護(hù)率達(dá)到91.67%，而且相對(duì)于之前的兩種福爾馬林滅活疫苗用量減少一半。程龍飛等[11]使用血清型1型和2型鴨疫里默氏菌分離株各6株，將細(xì)菌培養(yǎng)到一定數(shù)量后(1.0×107CFU)，腿部肌肉注射19日齡櫻桃谷鴨，篩選出1和2型各3株毒力較強(qiáng)的鴨疫里默氏菌菌株，研制出油乳劑滅活疫苗，首免5日齡櫻桃谷鴨，14日齡攻毒(每個(gè)血清型不同菌株之間都進(jìn)行攻毒處理)，各找到1株對(duì)其他菌株具有90%保護(hù)率的菌株，該菌株可以作為制備疫苗的理想的菌株。

1.1.3 氫氧化鋁膠滅活苗 1989年，日本學(xué)者Timms L M等[12]研究了鴨疫里默氏菌血清型G型(對(duì)應(yīng)血清型2型)的氫氧化鋁膠滅活苗，試驗(yàn)證明，在免疫后14 d保護(hù)效果最佳。1996年，泰國學(xué)者Pathanasophon P等[13]利用鴨疫里默氏菌肉湯培養(yǎng)液研制氫氧化鋁膠滅活苗，設(shè)計(jì)了不同疫苗濃度梯度試驗(yàn)、免疫后不同時(shí)間間隔攻毒試驗(yàn)和不同血清型之間交叉保護(hù)的試驗(yàn)。結(jié)果表明，正常濃度與兩倍正常濃度梯度的疫苗保護(hù)率之間沒有明顯差別，但是與稀釋10倍、100倍和1000倍的保護(hù)率差異性顯著；7日齡進(jìn)行首免的雛鴨，分別在14、21日齡和2、4、6月齡攻毒。結(jié)果顯示，在免疫該疫苗后14日齡保護(hù)率最高，保護(hù)指數(shù)(protection index，PI)為95.6。2002年，鄧舜洲等[14]通過培養(yǎng)鴨疫里默氏菌2型研制出氫氧化鋁膠滅活苗，于5日齡首免櫻桃谷鴨，5 d、10 d、15 d的攻毒試驗(yàn)證明，該疫苗的保護(hù)率達(dá)到50%～60%，25日齡進(jìn)行二免，5 d后攻毒，保護(hù)率達(dá)到91.7%。

1.1.4 添加免疫增強(qiáng)劑的滅活苗 在疫苗研制生產(chǎn)過程中，還有添加各種佐劑作為非特異性免疫增強(qiáng)劑來增強(qiáng)疫苗的免疫效果。蜂膠是一種傳統(tǒng)的天然藥物，富含大量多酚和黃酮類物質(zhì)。在畜牧生產(chǎn)方面，在日糧中適量添加蜂膠可以增加動(dòng)物機(jī)體的免疫力，提高動(dòng)物產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。蜂膠的免疫增強(qiáng)作用最早是蘇聯(lián)學(xué)者提出來的。我國首先將蜂膠應(yīng)用到動(dòng)物疫苗的是禽巴氏桿菌(C48-1菌株)蜂膠滅活苗，其保護(hù)率達(dá)到100%。蔡家利用鴨疫里默氏菌分離株制備的鴨疫里默氏菌蜂膠滅活疫苗保護(hù)效果良好，且雛鴨注射部位沒有出現(xiàn)結(jié)節(jié)、紅腫等現(xiàn)象。魏光河等[15]通過設(shè)計(jì)不同分組研究蜂膠多糖復(fù)合佐劑苗的免疫效果。結(jié)果證明，注射高濃度蜂膠多糖復(fù)合佐劑苗(1∶2)的組，產(chǎn)生抗體的時(shí)間最早，與其他組相比，抗體滴度最高，持續(xù)時(shí)間最長。

黃芪多糖作為一種常見的中藥提取成分，安全性高，有助于提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力。金爾光等[16]以鴨疫里默氏菌1型分離株為菌株，添加黃芪多糖佐劑，研制出滅活疫苗，于5日齡首免雛鴨，在第3、7、10、14、21天時(shí)攻毒，其保護(hù)率分別為100%、90%、100%、100%、90%；利用瓊脂擴(kuò)散法檢測發(fā)現(xiàn)，雛鴨從第3天開始就出現(xiàn)鴨疫里默氏菌的抗體，第10天時(shí)抗體滴度達(dá)到高峰，而且以黃芪多糖為佐劑的鴨疫里默氏菌滅活疫苗近7倍劑量頸部皮下注射5日齡櫻桃谷鴨，未見異常反應(yīng)。

1.1.5 多價(jià)滅活菌苗 鴨疫里默氏菌病在臨床上難以控制和預(yù)防的原因是其血清型種類多且各個(gè)血清型之間沒有交叉保護(hù)，在臨床上的某些癥狀又容易和大腸桿菌病和沙門氏菌病混淆，同時(shí)還與大腸埃希氏菌和沙門氏菌有交叉感染、繼發(fā)感染等，所以有學(xué)者將鴨疫里默氏菌的流行血清型放在一起研制多價(jià)苗。

多價(jià)滅活菌苗最早是1979年，美國學(xué)者Sandhu T S[17]根據(jù)當(dāng)時(shí)流行的1、2和5型研制出三價(jià)福爾馬林滅活苗和氫氧化鋁膠滅活苗，并在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中給10日齡和17日齡的雛鴨接種，攻毒后第2周和4周依然有良好的保護(hù)效果；將免疫后的雛鴨放養(yǎng)在野外，保護(hù)期可長達(dá)7周；該試驗(yàn)還證明不加氫氧化鋁膠的疫苗有更好的免疫效果。謝永平等[18]使用鴨疫里默氏菌1、2和3型血清型研制鴨疫里默氏菌油乳劑三價(jià)滅活疫苗，頸部皮下注射于7日齡櫻桃谷鴨，7 d后保護(hù)率為60%，15 d保護(hù)率達(dá)到100%，免疫期持續(xù)到42 d；ELISA檢測顯示，動(dòng)物體內(nèi)抗體從50 d開始出現(xiàn)下降，該實(shí)驗(yàn)還證明鴨疫里默氏菌病具有明顯的日齡抗性的特點(diǎn)。程龍飛等[19]使用血清型2和11型鴨疫里默氏菌分離株制備二價(jià)油乳劑滅活疫苗，皮下接種7日齡番鴨，并在首免后每隔7 d用ELISA法檢測血清總抗體水平。結(jié)果表明，首免后14 d開始產(chǎn)生抗體，28 d左右體內(nèi)抗體水平達(dá)到峰值，該疫苗保護(hù)率超過80%，最高可以達(dá)到91.3%，且血清中抗體可以持續(xù)2個(gè)月。

多價(jià)滅活菌苗安全性高，易于保存，無污染危險(xiǎn)，對(duì)母源抗體的中和作用不敏感，容易制成聯(lián)苗或多價(jià)苗。在添加了佐劑或免疫增強(qiáng)劑的疫苗中，蜂膠滅活疫苗安全性最高，刺激免疫個(gè)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的時(shí)間最早，但是免疫期較短。油乳劑滅活疫苗的保護(hù)率最高，經(jīng)過兩次以上的免疫，其保護(hù)效果可以達(dá)到91.3%，體內(nèi)抗體可以持續(xù)2個(gè)月。但是根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，注射油乳劑疫苗的部位，皮膚可能出現(xiàn)紅腫、結(jié)痂現(xiàn)象，故其安全性不及蜂膠滅活苗。滅活疫苗刺激的免疫反應(yīng)以體液免疫為主，對(duì)細(xì)胞外病原微生物能產(chǎn)生良好的抵御效果，但是不能激活機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)應(yīng)答，且滅活疫苗中抗原成分不高，所以保護(hù)力不及弱毒疫苗，需要加大劑量且多次免疫才能刺激機(jī)體產(chǎn)生長久的免疫力。

1.2 減毒活疫苗

活疫苗是指在人工條件下使病原體減毒或者從自然界篩選出無毒株或弱毒株制成的活的微生物制劑。由于滅活疫苗存在以上不足，故早在1984年，Layton H W等[20]就利用體外培養(yǎng)的血清型1、2和5型鴨疫里默氏菌菌株，處理后皮下注射免疫雛鴨，可以保護(hù)70%～85%的雛鴨不受以上3種血清型的侵襲，而未免疫的空白對(duì)照組雛鴨死亡率達(dá)90%～100%。將細(xì)菌培養(yǎng)物稀釋1/5，保護(hù)率仍高于80%。該實(shí)驗(yàn)室在長島養(yǎng)鴨場的實(shí)地研究表明，使用該細(xì)菌培養(yǎng)物免疫雛鴨，死亡率顯著降低。Sandhu T等[21]利用美國當(dāng)時(shí)流行的血清型1、2和5型鴨疫里默氏菌制作活疫苗，通過口服或氣霧劑的途徑免疫1日齡和7日齡北京鴨，分組觀察14 d、28 d、42 d。結(jié)果表明，單一血清型活疫苗對(duì)感染這一血清型鴨疫里默氏菌的雛鴨有很好的保護(hù)率，但對(duì)其他血清型沒有很好的保護(hù)率(0～52%)，且無論用什么途徑進(jìn)行活疫苗免疫，聯(lián)合血清型1、2和5型的三價(jià)活疫苗對(duì)感染以上3種血清型鴨疫里默氏菌的雛鴨均有良好的保護(hù)率(68%～100%)。

顯然，活疫苗的優(yōu)點(diǎn)是免疫次數(shù)少、抗體產(chǎn)生時(shí)間長、抗體滴度高，同時(shí)可以減輕動(dòng)物因注射疫苗產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，保證動(dòng)物胴體品質(zhì)。但由于活疫苗中含有的抗原就是病原微生物本身，所以臨床可能會(huì)出現(xiàn)毒力返祖的現(xiàn)象，因此在活疫苗研制時(shí)和投入使用前，需要進(jìn)一步確證。

1.3 菌體成分疫苗

菌體成分疫苗又分為亞單位疫苗和基因工程疫苗。由于鴨疫里默氏菌血清型種類多，各個(gè)血清型之間沒有交叉保護(hù)，且同一血清型的不同菌株其毒力也不盡相同，研制的多價(jià)苗或者單價(jià)苗若是與當(dāng)前地區(qū)流行菌株的血清型不同，也無法起到良好的保護(hù)作用，故研制鴨疫里默氏菌的亞單位疫苗就顯得尤為重要。

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)鴨疫里默氏菌亞單位疫苗的研制做了大量工作。亞單位疫苗重點(diǎn)集中在菌體成分和細(xì)菌莢膜上。林世棠等[22]通過培養(yǎng)血清1型鴨疫里默氏菌分離株，用十二烷基硫酸鈉(SDS)提取細(xì)菌的亞單位成分研制疫苗，首免7日齡的番鴨，試驗(yàn)組的平均保護(hù)率為92.5%，保護(hù)指數(shù)87.5，相對(duì)于只有60%存活率的對(duì)照組，提取的菌體亞單位成分對(duì)雛鴨具有很好的保護(hù)效果。TonB依賴性受體是活躍在革蘭氏陰性菌外膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，主要是幫助細(xì)菌吸收鐵離子和協(xié)助錳、VB12和碳水化合物的運(yùn)輸。但TbdR1(TonB-dependent receptor 1)除了轉(zhuǎn)運(yùn)功能以外，還是一個(gè)毒力因子，在血清型1、2、10型的鴨疫里默氏菌中，是具有交叉免疫原性的抗原。羅雅莉等[23]利用鴨疫里默氏菌DSM15868 株的TbdR1的序列生物學(xué)信息，分兩段表達(dá)TbdR1的抗原表位，構(gòu)建表達(dá)載體，將重組蛋白表達(dá)和純化后用弗氏完全佐劑乳化，皮下注射2日齡雛鴨，免疫18 d后，用10倍LD50的劑量攻毒。結(jié)果表明，兩個(gè)單一蛋白片段均對(duì)雛鴨有一定的保護(hù)作用，兩個(gè)片段同時(shí)免疫時(shí)保護(hù)率達(dá)到50%。除了TbdR1外，還有OmpA、CAMP cohemolysin、VapD和Sip(siderophore-inferacting)毒力因子。Li T等[24]最近發(fā)現(xiàn)，M949-RS00050基因也與鴨疫里默氏菌的毒力有關(guān)。Subramaniam S等[25]發(fā)現(xiàn)OmpA基因是鴨疫里默氏菌外膜上與其毒力相關(guān)的基因，表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量為42 ku，它也是鴨疫里默氏菌感染宿主很重要的一個(gè)抗原物質(zhì)，與鴨疫里默氏菌各種血清型無關(guān)。也有研究表明，毒力因子CAMP cohemolysin在血清型1、2、3、5、6和19型鴨疫里默氏菌菌株中都有表達(dá)，Sip在鴨疫里默氏菌鐵攝取系統(tǒng)中有重要作用，與細(xì)菌的毒力大小有重要聯(lián)系，此發(fā)現(xiàn)將為以后研究鴨疫里默氏菌亞單位疫苗克服不同血清型之間無交叉保護(hù)的弊端提供理論依據(jù)。

亞單位疫苗中沒有細(xì)菌的核酸成分，安全性高，雖然有些細(xì)菌血清型較多，血清型之間沒有交叉保護(hù)，但是由于菌體成分上決定細(xì)菌毒性的基因序列是相同的，因此利用這個(gè)特點(diǎn)可以改善普通疫苗保護(hù)率低和克服使用弱毒疫苗時(shí)不能使用抗生素的問題。但是亞單位疫苗相對(duì)于其他類型的疫苗，研制成本較高，在市場上推廣較困難，因此亞單位疫苗的研究進(jìn)展受到了限制。

1.4 聯(lián)苗

聯(lián)苗是由兩個(gè)或多個(gè)滅活的生物體或者提純的抗原聯(lián)合配制而成，用于預(yù)防多種疾病。1985年，Sandhu T S和Layton H W[26]研制出O78大腸桿菌和鴨疫里默氏菌二聯(lián)苗，在2周齡和3周齡的北京鴨上接種后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室和野外試驗(yàn)，結(jié)果證明該疫苗可以保護(hù)雛鴨不受強(qiáng)毒O78大腸桿菌和血清1型、2型和5型鴨疫里默氏菌的感染。劉曉文等[27]研制了鴨坦布蘇病毒(Duck Tambusu virus disease，DTMUV)、鴨源大腸埃希氏菌和鴨疫里默氏菌三聯(lián)苗，選取的分別是鴨坦布蘇病毒GDNS2010.1株、鴨源大腸埃希氏菌O1株和鴨疫里默氏菌2型。于10日齡首免麻鴨，隨后在31日齡二免和100日齡三免。結(jié)果顯示，免疫一次，三聯(lián)苗對(duì)大腸埃希氏菌和鴨疫里默氏菌攻毒的保護(hù)率為70%和60%，二免的保護(hù)率均為90%，三免則達(dá)到100%。因此，臨床上可以根據(jù)實(shí)際情況對(duì)蛋鴨、雛鴨進(jìn)行三次免疫，即可達(dá)到良好的免疫效果。除了以上用不同細(xì)菌的培養(yǎng)物制作滅活聯(lián)苗之外，也有利用細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建細(xì)菌的多型融合子，這樣可以克服鴨疫里默氏菌血清型多且沒有交叉保護(hù)的問題，也能將不同細(xì)菌的免疫原性物質(zhì)集中在同一個(gè)細(xì)菌上，這對(duì)鴨疫里默氏菌疫苗的研制具有極大的啟發(fā)作用。王春平等[28]利用鴨疫里默氏菌和鴨大腸埃希氏菌的優(yōu)勢(shì)血清型 TXRA1和ZBO78進(jìn)行融合試驗(yàn)，培育出耐藥標(biāo)記菌株鴨疫里默氏菌TXRA1(Chlr，Erys)和鴨大腸埃希氏菌ZBO78(Eryr，Chls)融合菌株，這為以后鴨疫里默氏菌聯(lián)苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

除以上幾類疫苗外，Wu H C等[29]研究了傳統(tǒng)的滅活疫苗與使用DNA和蛋白質(zhì)亞單位疫苗(DNA+蛋白質(zhì)亞單位、蛋白質(zhì)亞單位+蛋白質(zhì)亞單位、蛋白質(zhì)亞單位+滅活疫苗、DNA+DNA)的免疫方案。結(jié)果表明，與滅活疫苗相比，DNA+蛋白質(zhì)亞單位疫苗誘導(dǎo)的抗體水平更高，顯著提高了CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的比例，并使IFN-γ、IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)水平升高，且以DNA為主要成分的疫苗用來免疫和加強(qiáng)免疫，可以誘發(fā)強(qiáng)烈而長期的免疫反應(yīng)；隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)和疫苗學(xué)研究的最新進(jìn)展，使用DNA+蛋白質(zhì)亞單位的疫苗有望被廣泛用于預(yù)防鴨疫里默氏菌病。蛋白質(zhì)亞單位疫苗往往引起抗體高水平，而表達(dá)內(nèi)源性抗原的DNA疫苗可以誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，使用DNA+蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫接種后不僅可以預(yù)防細(xì)菌性疾病，還可以有效地預(yù)防病毒性疾病。

2 展望

近幾年來看，我國鴨疫里默氏菌病嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展，并因此造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。由于鴨疫里默氏菌病經(jīng)常與大腸桿菌病合并發(fā)生，故給該病的確診帶來一定困難。鴨疫里默氏菌的血清型復(fù)雜多樣，不同地區(qū)流行的血清型可能大不相同，且各個(gè)血清型之間沒有交叉保護(hù)作用，這些也給該病的防治帶來極大的難度。所以，為了更好地預(yù)防和控制該病，應(yīng)當(dāng)找到一種臨床鑒別該病的快速診斷方法，以便更加高效和快速地診斷出該病。同時(shí)，在研究滅活疫苗或者減毒活疫苗時(shí)，要從各個(gè)地區(qū)流行的血清型中找到毒力較強(qiáng)的菌株，從而研制出安全、高效、可以重復(fù)使用的多價(jià)苗，以打破普通單價(jià)疫苗保護(hù)機(jī)體的單一性，從而更好地預(yù)防鴨群的鴨疫里默氏菌病。隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，鴨疫里默氏菌的相關(guān)毒力基因或者免疫原性基因被相繼發(fā)現(xiàn)，也能推動(dòng)有關(guān)菌體成分疫苗的研究，有望在生產(chǎn)實(shí)踐中得以更好地應(yīng)用。