王 勃，王 忠，連 軍，周 蓓，呂曉敏，從美麗，趙效國(guó)

(新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，新疆烏魯木齊 830011)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生物醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件。近交系小鼠是科研實(shí)驗(yàn)中最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，但繁殖代數(shù)的增加，繁育條件的偏差，殘留的基因雜合及可能的基因突變會(huì)造成遺傳背景發(fā)生改變，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，甚至出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果[1]。在較大規(guī)模飼養(yǎng)不同品系的近交系小鼠時(shí)，要保證品系的正確可靠，需對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。目前，用于監(jiān)測(cè)小鼠品系和遺傳特征的方法主要是免疫標(biāo)記和生化標(biāo)記等表型檢測(cè)方法，這些方法對(duì)于近緣品系(如各近交系的亞系)的近交系小鼠的區(qū)分能力不足，而且檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)量也有限[2]，因此實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量的檢測(cè)也從動(dòng)物表型的研究漸漸趨向于對(duì)于 DNA 分子標(biāo)記的探索，對(duì)小鼠基因組 DNA 序列的檢測(cè)是最直接有效的遺傳學(xué)鑒定方法，而且隨著基因檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，在 DNA 水平對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行遺傳監(jiān)測(cè)也是大勢(shì)所趨[3-5]。

隨著生物醫(yī)學(xué)研究的不斷發(fā)展和深入，為滿(mǎn)足新疆地區(qū)教學(xué)科研對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量需求和質(zhì)量要求，新疆醫(yī)科大學(xué)新建動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心通過(guò)驗(yàn)收評(píng)審啟用，從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司重新引種繁育。在原有工作經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，存在管理方式的改變和改進(jìn)，以及飼養(yǎng)人員的變動(dòng)。飼養(yǎng)繁育期間，曾出現(xiàn)過(guò)大小鼠脫毛的現(xiàn)象，通過(guò)改善飼料滅菌工藝和添加營(yíng)養(yǎng)元素等方式，脫毛現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)[6]。但隨著繁殖代數(shù)增加，以及管理和飼養(yǎng)等因素的改變，是否存在遺傳基因突變的情況是未知的。因此，為進(jìn)一步探究近交系小鼠的遺傳質(zhì)量穩(wěn)定，該試驗(yàn)通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)生產(chǎn)群中的兩個(gè)品系(Balb/cByJ 和C57BL/6J)小鼠的112 個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了分型研究，確認(rèn)所飼養(yǎng)繁育的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量穩(wěn)定，為該地生物醫(yī)學(xué)研究數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 2017年5月，Balb/cByJ和C57BL/6J兩個(gè)品系近交系小鼠引種自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2017-0005]，飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)環(huán)境[SYXK(新)2018-0002]。2019年9月，選取16只6周齡左右SPF級(jí)小鼠，Balb/cByJ的雌雄各4只，分別標(biāo)記為B♂1、B♂2、B♂3、B♂4、B♀1、B♀2、B♀3、B♀4，C57BL/6J的雌雄各4只，分別標(biāo)記為C♂1、C♂2、C♂3、C♂4、C♀1、C♀2、C♀3、C♀4，剪取1 cm尾巴用于DNA提取，置于-20℃冰箱備用。

1.1.2 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(T100)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀(EPS 300)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置(FR-200A)、生物電泳圖像分析系統(tǒng)(FR-980B)，上海復(fù)日科技有限公司產(chǎn)品；微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop)，美國(guó)ThermoFischer公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 PCR 引物(PAGE 純化)，上海百力格生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；dNTP，上海有漁生物工程有限公司產(chǎn)品；PCR用Taq酶和緩沖液，該實(shí)驗(yàn)室自制；動(dòng)物基因組抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 小鼠DNA提取使用動(dòng)物基因組抽提試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA質(zhì)量，用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和質(zhì)量后置于20℃冰箱保存。

1.2.2 多重PCR擴(kuò)增目的片段 選取均勻分布于小鼠19條常染色體及X染色體上的112個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型[7]，將112對(duì)引物等比例混合后稀釋成0.2 mol/L的儲(chǔ)存液備用。PCR反應(yīng)體系(10 μL)包括:小鼠基因組DNA 15 ng～20 ng，20 mol/L dNTPs，10 mmol/L Mg2+，0.02 mol引物和0.5 U熱啟動(dòng)Taq酶。按以下熱循環(huán)程序進(jìn)行第一輪多重PCR擴(kuò)增：95℃熱變性15 min；94℃ 30 s，60℃ 10 min,72℃ 30 s(4個(gè)循環(huán))；再進(jìn)行94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s(24個(gè)循環(huán))。

1.2.3 第二輪PCR建庫(kù) 第一輪得到的產(chǎn)物稀釋10倍，用于第二輪建庫(kù)PCR的模板。在第二輪PCR體系(20 μL)包含：模板10 μL，引物0.04 μL，20 mol/L dNTPs，10 mmol/L Mg2+和 0.5 U熱啟動(dòng)Taq酶，按照以下程序進(jìn)行建庫(kù)PCR反應(yīng)：95℃熱變性15 min；94℃ 30 s，60℃ 4 min,72℃ 30 s(5個(gè)循環(huán))，再進(jìn)行94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 30 s(25個(gè)循環(huán))，72℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察電泳條帶是否均一，是否有雜帶等。

1.2.4 利用二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行SNP基因型檢測(cè) 將經(jīng)建庫(kù)PCR擴(kuò)增的文庫(kù)上樣電泳，電泳完畢后，割取目標(biāo)片段，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物精確定量并稀釋至測(cè)序所需濃度。建庫(kù)產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司，用安捷倫2200毛細(xì)管電泳儀質(zhì)控后進(jìn)行高通量測(cè)序，使用機(jī)型為Illumina X-10。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析和SNP鑒定 測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina bcl2fastq軟件轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，結(jié)果以 Fastq文件格式存儲(chǔ)。利用FASTQC[8]對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控，并根據(jù)條形碼序列分離出所有樣本。使用BWA(v0.7.12)和Samtools(v0.1.19)軟件[9]鑒定SNP位點(diǎn)。過(guò)濾小于15×測(cè)序深度位點(diǎn)，雜合子判定標(biāo)準(zhǔn)為等位基因的序列讀長(zhǎng)比例在20%～80%。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR產(chǎn)物的質(zhì)量控制

30 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察二輪PCR產(chǎn)物的效果，確定每只小鼠樣本都擴(kuò)增成功，主帶位于400 bp(圖1)，用凝膠回收試劑盒回收主帶。文庫(kù)純化后，以Agilent 2200對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)控，主峰位置400 bp，質(zhì)控合格(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1～16.B♀1、B♀2、B♀3、B♀4、B♂1、B♂2、B♂3、B♂4、C♀1、C♀2、C♀3、C♀4、C♂1、C♂2、C♂3、C♂4

圖2 Agilent 2200檢測(cè)結(jié)果

2.2 送檢小鼠的SNP檢測(cè)結(jié)果

對(duì)16只小鼠的112個(gè)SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序，得到有效讀取數(shù)為6 118 873，每個(gè)位點(diǎn)的平均讀取數(shù)為3 631，97個(gè)SNP位點(diǎn)在所有的小鼠中都被分型，另外15個(gè)SNP位點(diǎn)，至少在1只小鼠中沒(méi)有分型結(jié)果，被檢小鼠的這15個(gè)SNP的分型結(jié)果如圖3所示。15個(gè)SNP在被檢小鼠中的詳細(xì)分型結(jié)果見(jiàn)表1。rs13476971，rs3668927，rs3685276，rs3693131和rs3694100等5個(gè)SNP只在C57小鼠中被檢測(cè)出來(lái)，而rs13476630只在C57小鼠中被檢測(cè)，rs6373756雖然在15只小鼠中都被正確分型但是在Balb/c小鼠中的平均讀取數(shù)(4 272±1 404)遠(yuǎn)大于C57小鼠(254±88)。另外，還發(fā)現(xiàn)有些SNP位點(diǎn)的檢測(cè)出現(xiàn)了性別偏差，比如，rs13484115和rs13484116只在雄鼠中被檢測(cè)，而雌鼠中沒(méi)有分型結(jié)果。

表1 未被全部檢出的15個(gè)SNP的檢測(cè)結(jié)果

圖3 不完全檢出的15個(gè)SNP在16只送檢小鼠中的分型結(jié)果

2.3 送檢小鼠的SNP分型結(jié)果

對(duì)所有送檢的16只小鼠進(jìn)行SNP分型結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示，在檢出的SNP位點(diǎn)未出現(xiàn)雜合子現(xiàn)象。小鼠樣本的分型結(jié)果在Jackson數(shù)據(jù)庫(kù)中能找到與其分型完全匹配的品系，品系名稱(chēng)為C57BL/6J或?yàn)锽alb/cByJ。

表2 小鼠的SNP分型結(jié)果

3 討論

在近交系小鼠的保種和繁育生產(chǎn)過(guò)程中，雖有嚴(yán)格的要求，但仍存在著發(fā)生遺傳污染或遺傳漂變等風(fēng)險(xiǎn)。一個(gè)外源的動(dòng)物與近交系的動(dòng)物意外交配會(huì)導(dǎo)致近交系動(dòng)物遺傳基因改變。這種類(lèi)型的遺傳污染，會(huì)導(dǎo)致等位基因突然和大量交換，特別是在具有相似毛色的品系之間[10]。無(wú)品系間遺傳污染是近交系動(dòng)物的基本要求，可通過(guò)定期開(kāi)展生化標(biāo)記檢測(cè)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。但同一品系動(dòng)物在不同的地方獨(dú)立繁育，也會(huì)發(fā)生遺傳漂變產(chǎn)生亞系，可用分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)小鼠遺傳狀況。

隨著對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SNP檢測(cè)需求的不斷增加，用于遺傳鑒定的新的SNP檢測(cè)技術(shù)和手段也層出不窮。如施長(zhǎng)根等[11]用熔解曲線(xiàn)法對(duì)小鼠單倍體細(xì)胞進(jìn)行遺傳性別的鑒別；Zhang Jian等[12]用靶向SNP測(cè)序檢測(cè)了黃瓜的遺傳多樣性。我們通過(guò)多重靶向PCR結(jié)合二代測(cè)序[13]對(duì)近交系小鼠生產(chǎn)群中的16只小鼠進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證，相較于其它傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)等品系鑒定方法，這種SNP分型方法結(jié)果更為直觀可靠，而且性?xún)r(jià)比高、特異性強(qiáng)，而且多重靶向平臺(tái)用于SNP的分型已經(jīng)得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[14-15]。所選的112個(gè)SNP涵蓋了小鼠基因組的19條常染色體和1條性染色體(X染色體)，在近交系小鼠中具有較高的多態(tài)性，能夠鑒定所有的近交系小鼠品系。

盡管不是所有的SNP位點(diǎn)在16只小鼠中都有分型結(jié)果，但每只小鼠至少有100個(gè)以上的SNP位點(diǎn)得到了驗(yàn)證，且均為純合子，與公布的品系一致。但我們也發(fā)現(xiàn)用二代測(cè)序?qū)@些SNP位點(diǎn)的檢測(cè)有一些偏向性，比如有些SNP只在C57BL/6J或?yàn)锽alb/cByJ中的一種品系的小鼠中被分型，而另一個(gè)品系的小鼠卻幾乎檢測(cè)不到讀取片段，而有的SNP位點(diǎn)在不同性別的小鼠中分型效率也存在很大差異。這些差異基本上是由第一輪多重PCR同時(shí)對(duì)112個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)造成的，由于兩個(gè)不同品系的小鼠在每個(gè)SNP位點(diǎn)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物有1個(gè)堿基的差異，可能會(huì)造成PCR擴(kuò)增效率的輕微差異，如果是單重的PCR反應(yīng)，這種差異幾乎不會(huì)對(duì)終產(chǎn)物造成可被觀察到的影響，而對(duì)于多重PCR反應(yīng)而言，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，多重反應(yīng)之間的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)將輕微的擴(kuò)增效率的差異不斷地?cái)U(kuò)大，導(dǎo)致最終有一種產(chǎn)物檢測(cè)不到[16]。

由于112個(gè)SNP位點(diǎn)是針對(duì)所有近交系小鼠品系設(shè)計(jì)的，對(duì)于某一個(gè)特定品系的小鼠定種的話(huà)，所需檢測(cè)的SNP數(shù)量會(huì)遠(yuǎn)小于112個(gè)，因此在對(duì)這兩個(gè)品系小鼠進(jìn)行遺傳質(zhì)量鑒定時(shí)，并不要求所有112個(gè)SNP位點(diǎn)都有結(jié)果。通過(guò)分析該試驗(yàn)得到的結(jié)果，已經(jīng)足夠能鑒定出這16只Balb/cByJ和C57BL/6J小鼠都與其預(yù)期的品系一致。用多重靶向PCR結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行SNP分型，能夠?qū)幌敌∈蟮倪z傳特性進(jìn)行快速準(zhǔn)確的評(píng)估。