吳圓圓,屈勇剛*,于會(huì)舉,谷思穎,魏 其,梁 晏,吳 勤,張湘莉蘭,童貽剛

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.石河子大學(xué)分析測(cè)試中心，石河子 832003；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071；4.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌屬(Escherichia)成員之一[1]，一般不致病，多為條件致病菌。1894年，首次有了關(guān)于雞大腸埃希氏菌的報(bào)道，隨后世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)逐漸有了關(guān)于大腸桿菌病不同病型的報(bào)道[2-5]，由多種致病因子結(jié)合的禽致病性大腸埃希氏菌(Avian pathogenicE.coli,APEC)，可導(dǎo)致禽類的多種癥狀，最常見(jiàn)的是死胚、敗血癥、心包炎、卵黃性腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、氣囊炎、肉芽腫等[6-7]。由于臨床上抗菌藥物的長(zhǎng)期、不合理使用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷增多[8]。因此，急切地需要新型藥物的研發(fā)，以控制耐藥性致病菌引起的感染。噬菌體是一種廣泛存在于自然界中的病毒，對(duì)其宿主菌具有高效特異性的感染，并且不出現(xiàn)耐藥性。近年來(lái)噬菌體已應(yīng)用于臨床疾病的治療，并具有良好的效果[9-13]。在現(xiàn)今雞大腸桿菌病治療的基礎(chǔ)上，筆者以本實(shí)驗(yàn)室前期分離得的雞致病性大腸埃希氏菌為宿主菌分離噬菌體，經(jīng)過(guò)篩選得到一株裂解性噬菌體，分析了其部分其生物學(xué)特征，并進(jìn)行了全基因組測(cè)序及分析，為該噬菌體用于臨床治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和水樣 45株雞大腸埃希氏菌均由石河子大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定與保存，污水采于石河子市及周邊養(yǎng)雞場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 DNaseI、RNase A、Mung Bean Nuclease、病毒總基因提取試劑盒為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；PEG4000為天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心產(chǎn)品；SM緩沖液、PBS緩沖液、LB的液體/半固體/固體培養(yǎng)基均在石河子大學(xué)動(dòng)科院傳染病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)配制所得。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(Multifuge XLR)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(HT7700)，日立(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；測(cè)序儀(Miseq)，美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 宿主菌的準(zhǔn)備 將本實(shí)驗(yàn)室保存于-80℃超低溫冰箱中的45株雞大腸埃希氏菌置于4℃環(huán)境下解凍。挑取在LB固體平板上劃線生長(zhǎng)出的單一菌落分別接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37℃、160 r/min條件下過(guò)夜富集培養(yǎng)，后置4℃保存。

1.2.2 噬菌體的分離與純化 參考文獻(xiàn)[14-15]方法將污水水樣依次經(jīng)過(guò)無(wú)菌紗布和濾紙過(guò)濾，得到的濾液置于4℃過(guò)夜后，再用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。取除菌的污水濾液與45株雞大腸埃希氏菌各菌懸液依次加于液體LB培養(yǎng)基中，于錐形瓶中混勻，室溫靜止15 min，37℃、160 r/min培養(yǎng)7 h并于4℃過(guò)夜，10 000 r/min離心10 min，取上清液分別與45株雞大腸埃希氏菌菌懸液混合吸附后，用雙層瓊脂平板法過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行噬菌體的分離。

用無(wú)菌牙簽挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)噬菌空斑至于100 μL相應(yīng)宿主菌，吸附反應(yīng)15 min，加入5 mL 液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5 h，將離心倍比稀釋的培養(yǎng)液與宿主菌混合均勻后采用雙層瓊脂法培養(yǎng)，如此過(guò)程重復(fù)3次以上，直至在一個(gè)平板上形成形態(tài)單一的噬菌斑。即可得到純的噬菌體原液，將其置于-80℃(與500 mL/L甘油等體積混勻)保存和4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 噬菌體的濃縮及電鏡觀察 參考文獻(xiàn)[16]，采用超速離心法，進(jìn)行噬菌體濃縮，將裂解液上清在4℃下24 446×g，離心1.5 h，用 SM緩沖液輕輕洗脫重懸每個(gè)離心管中的沉淀，最后將得到的濃縮液收集在1.5 mL無(wú)菌離心管中保存于-80℃?zhèn)溆?。?0 μL噬菌體濃縮液滴于載玻片上，用精細(xì)鑷子輕輕夾取銅網(wǎng)(200目)放于噬菌體濃縮液液滴上，室溫下吸附2 min后取出，放于吸水紙上，去除銅網(wǎng)上的液體，滴一滴20 g/L的磷鎢酸染液在銅網(wǎng)上，靜置染色3 min取出，放于吸水紙上，用紅外燈照射30 min，以徹底除去水分與有害雜質(zhì)后，用HT7700透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)。

1.2.4 噬菌體核酸類型的鑒定 噬菌體基因組的提取嚴(yán)格按照病毒基因DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟進(jìn)行，將提取的核酸于37℃水浴條件下，用DNase Ⅰ、RNase A與Mung Bean Nuclease分別對(duì)噬菌體的基因組消化2 h后，采用瓊脂凝膠電泳法對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 噬菌體全基因組的測(cè)序 將噬菌體基因組處理為約290 bp的測(cè)序文庫(kù)，利用Miseq測(cè)序儀完成測(cè)序工作，使用軟件Newbler 2.9與CLC 3.0對(duì)得到的基因組序列進(jìn)行序列組裝。測(cè)序工作由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物學(xué)流行病學(xué)研究所完成。利用MEGA7.0對(duì)所得序列進(jìn)行親緣關(guān)系的構(gòu)建。

1.2.6 噬菌體裂解譜的測(cè)定 取100 μL噬菌體原液以1∶1分別與被調(diào)查的45株雞大腸埃希氏菌菌懸液吸附反應(yīng)15 min,雙層瓊脂法過(guò)夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.2.7 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)的測(cè)定 將宿主菌培養(yǎng)至OD600≈0.5(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，以固定的對(duì)數(shù)宿主菌液(100 μL)，按照感染復(fù)數(shù)分別為0.000 000 1、0.000 001、0.000 01、0.000 1、0.001、0.01、0.1、1的比例加入相應(yīng)體積的噬菌體液并混勻，靜置吸附15 min，均補(bǔ)加LB液體培養(yǎng)基至2 mL，振蕩培養(yǎng)4 h。10 000 r/min離心10 min，取上清，10倍倍比稀釋后，與培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液混合吸附，用雙層瓊脂法測(cè)定上述比例培養(yǎng)液的噬菌體滴度，滴度最高者即為最佳MOI。

1.2.8 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液(100 ml)與噬菌體液按MOI=0.001混勻，并在靜置吸附20 min后補(bǔ)加LB至200 mL，此為時(shí)間0，37℃、160 r/min，在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、110 min、130 min、150 min、170 min、190 min、210 min，19個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取2 mL，離心、稀釋、吸附，做3次重復(fù)試驗(yàn)，每次2個(gè)平行，采用雙層瓊脂法測(cè)定噬菌體滴度，并根據(jù)滴度繪制噬菌體感染宿主菌的一步生長(zhǎng)曲線。

1.2.9 噬菌體pH敏感性的測(cè)定 取100 μL噬菌體液分別接種于900 μL不同pH(pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)的LB液中，37℃水浴孵育2 h，稀釋、吸附，用雙層瓊脂法測(cè)定噬菌體滴度。觀察噬菌體的生長(zhǎng)情況，繪制曲線。

1.2.10 噬菌體耐熱穩(wěn)定性的測(cè)定 分別取300 μL 效價(jià)為5.5×109PFU/mL的噬菌體原液于若干滅菌離心管中，將之分別置于40、50、60、70、80℃條件下處理，在0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min、160 min、180 min，10個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣并迅速放置于4℃，稀釋、吸附、倒板，測(cè)定其不同溫度下、不同時(shí)間點(diǎn)噬菌體的滴度，繪制熱穩(wěn)定性曲線。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離與純化

本試驗(yàn)以45株雞大腸埃希氏菌與污水水樣共培養(yǎng)，采用雙層瓊脂平板法經(jīng)5次反復(fù)純化，在平板上生長(zhǎng)的噬菌斑形態(tài)、大小均單一，得到1株裂解性噬菌體，其噬菌斑形態(tài)和大小見(jiàn)圖1，噬菌斑呈透亮的圓形，直徑0.8 mm～1.1 mm，邊緣整齊無(wú)暈環(huán)，將此噬菌體命名為vB-EcoM-IME540。

圖1 噬菌體vB-EcoM-IME540的噬菌斑形態(tài)

2.2 噬菌體的電鏡形態(tài)

透射電鏡觀察結(jié)果，如圖2所示，噬菌體vB-EcoM-IME540的頭部呈橢圓形且尾部具有收縮性，頭尾被頸圈分開(kāi)，頭大小約106.7 nm×73.3 nm，尾長(zhǎng)約140 nm×16.7 nm。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)在2011年發(fā)布的第9次報(bào)告中噬菌體的分類與命名標(biāo)準(zhǔn)，噬菌體vB-EcoM-IME540屬有尾噬菌體目(Caudovirales)，肌尾噬菌體科(Myoviridae)。

圖2 噬菌體vB-EcoM-IME540的透射電鏡照片

2.3 噬菌體的核酸類型鑒定

噬菌體核酸瓊脂凝膠電泳結(jié)果，如圖3所示，噬菌體vB-EcoM-IME540的核酸只能被DNase Ⅰ消化，卻不能被RNase A與Mung Bean Nuclease消化，表明該噬菌體核酸為雙鏈DNA(Double-stranded DNA,dsDNA)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.vB_EcoM-IME540核酸；2.DNase Ⅰ；3.RNase A；4.Mung Bean Nuclease

2.4 噬菌體的全基因組測(cè)序及親緣性分析

由測(cè)序結(jié)果可知，噬菌體vB-EcoM-IME540的全基因組大小為170 237 bp，G+C含量為39.46 %，在DNAMan上序列組成分別為A:30.7%、C:19.1%、G:20.3%、T:29.8%，由此可知此噬菌體的核酸類型為dsDNA。利用MEGA7.0.26與NCBI上基因庫(kù)中的親緣噬菌體進(jìn)行基因比對(duì)，制作其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4，通過(guò)Blastn發(fā)現(xiàn)vB-EcoM-IME540與NCBI上發(fā)布的大腸桿菌噬菌體Bp7的相似性為97.44%(Bp7的GenBank登錄號(hào)為NC019500.1)，并已知大腸桿菌噬菌體Bp7是肌尾科噬菌體，結(jié)合電鏡形態(tài)觀察可將噬菌體vB-EcoM-IME540歸類為肌尾噬菌體家族。

圖4 噬菌體vB_EcoM_IME540的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.5 噬菌體的裂解譜

噬菌體vB-EcoM-IME540與45株雞大腸埃希氏菌作用，測(cè)定其裂解譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體vB-EcoM-IME540只對(duì)其中3株雞大腸埃希氏菌有裂解作用，裂解率約為6.67%(3/45)。

2.6 噬菌體的最佳MOI

不同比例的噬菌體與宿主菌反應(yīng)時(shí)，子代噬菌體的產(chǎn)生情況也大不相同，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)MOI=0.000 001時(shí)，產(chǎn)生的子代噬菌體滴度最高，見(jiàn)圖5。因此，噬菌體vB-EcoM-IME540感染宿主菌的最佳MOI為0.000 001。

圖5 噬菌體vB-EcoM-IME540的感染復(fù)數(shù)

2.7 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線

裂解性噬菌體的感染過(guò)程經(jīng)歷吸附、穿入、合成與裂解釋放4個(gè)階段，可用一步生長(zhǎng)曲線進(jìn)行描述與展示。從圖6可以清晰地看出，噬菌體vB-EcoM-IME540增殖的潛伏期、裂解期、平穩(wěn)期以及裂解量；其中潛伏期大約為20 min，裂解爆發(fā)期約為130 min，裂解量約為23 PFU/cell；大約在噬菌體感染宿主菌的150 min進(jìn)入平穩(wěn)期，此時(shí)宿主菌全部裂解，噬菌體數(shù)量達(dá)到最高。

圖6 噬菌體vB-EcoM-IME540的一步生長(zhǎng)曲線

2.8 噬菌體的pH敏感性

由圖7可知，噬菌體vB-EcoM-IME540在pH為4.0～13.0之間對(duì)噬菌體的影響不大，其效價(jià)無(wú)明顯變化并保持在較高水平。在pH為3.0時(shí)其活性明顯降低，在2.0時(shí)失去活性；在pH為13.0時(shí)，效價(jià)仍處于較高水平且明顯高于3.0，說(shuō)明噬菌體vB-EcoM-IME540具有強(qiáng)耐堿性。

圖7 噬菌體vB-EcoM-IME540的pH敏感性

2.9 噬菌體的耐熱穩(wěn)定性

由圖8可知，噬菌體vB-EcoM-IME540在40℃、50℃條件下作用2 h時(shí)，噬菌體效價(jià)大約下降了13.0%；60℃作用2 h，大約下降了49.0%；70℃作用20 min，效價(jià)下降了60.0%；80℃作用20 min，噬菌體失活。

圖8 噬菌體vB-EcoM-IME540的耐熱穩(wěn)定性

3 討論

噬菌體與其細(xì)菌宿主的進(jìn)化密切相關(guān)，并經(jīng)常提供毒力因子，使得噬菌體的研究對(duì)于理解致病株的進(jìn)化具有重要意義。本試驗(yàn)利用噬斑形成試驗(yàn)與雙層瓊脂平板培養(yǎng)法從污水中分離、純化裂解性雞大腸埃希氏菌噬菌體，并將其暫時(shí)命名為vB-EcoM-IME540，其代表意義可參考張倩等[17]對(duì)其的解釋。

通過(guò)對(duì)噬菌體電鏡觀察、全基因組測(cè)序的比對(duì)和聚類分析知噬菌體vB-EcoM-IME540與噬菌體Enterobacteriaphage Bp7(有尾噬菌體目的肌尾噬菌體)親緣性最好，其全基因組序列覆蓋率高達(dá) 97%。在國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)的最新報(bào)道中，又將此噬菌體劃分為dsDNA病毒。噬菌體vB-EcoM-IME540在pH為5.0～13.0時(shí)均有很高的活性，與孫利廣[18]等報(bào)道的V-EcoM-C1(pH5.0～10.0)相比，具有較強(qiáng)耐堿性；在50℃內(nèi)具有穩(wěn)定的活性，70℃下40 min仍具有活性，與本實(shí)驗(yàn)室分離的噬菌體EcP5[19]相比有一定耐高溫性；裂解范圍與王禮偉[20]分離的EcP10相比較窄，因僅對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的雞源大腸埃希氏菌進(jìn)行了裂解譜測(cè)定試驗(yàn)，而對(duì)其他種源大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等菌屬是否具有裂解能力尚不清楚，需要進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)加以驗(yàn)證分析。感染宿主菌的潛伏期約為20 min，暴發(fā)期時(shí)間維持約130 min，裂解量23，具有較強(qiáng)的裂解活性；在較低的最佳感染復(fù)數(shù)0.000 001時(shí)，有較高的殺菌效率。綜合以上信息，本次試驗(yàn)中分離的噬菌體vB-EcoM-IME540是一株能裂解雞大腸埃希氏菌的有尾噬菌體目肌尾噬菌體科的dsDNA噬菌體，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。