謝曉剛，李 丹，羅 艷，賈燕青，薛增迪，張振倉(cāng)，馬乃祥，權(quán)富生*

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

奶牛乳腺炎(Cow mastitis)是指奶牛乳腺組織代謝紊亂，或者受到物理或化學(xué)刺激后對(duì)病原微生物入侵易感而造成的炎癥，是奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，會(huì)影響奶牛產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)病牛會(huì)面臨被淘汰的風(fēng)險(xiǎn)，給奶牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在畜牧生產(chǎn)上，造成奶牛乳腺炎的病原微生物主要有大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。大腸埃希氏菌廣泛存在于糞便、墊料以及飼料中，若工作人員在擠奶過(guò)程中操作不當(dāng)，會(huì)造成大腸埃希氏菌入侵乳房引發(fā)急性乳腺炎；而金黃色葡萄球菌具有一定的黏附性，常通過(guò)皮膚傳播，最后定植于乳腺上皮細(xì)胞，產(chǎn)生腸毒素等導(dǎo)致宿主細(xì)胞過(guò)度表達(dá)炎性介質(zhì)造成持續(xù)的炎癥反應(yīng)，引起慢性乳腺炎[2-4]。因此，研究奶牛乳腺炎致病機(jī)理對(duì)臨床生產(chǎn)上防控乳腺炎尤為重要。

circRNA是pre-mRNA的反向剪切或外顯子跳躍產(chǎn)生的首尾相接的單鏈閉合環(huán)狀分子[5]，其具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)[6]；調(diào)節(jié)mRNA的可變剪切、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程[7]；作為microRNA的“分子海綿”[8]；作為蛋白海綿或蛋白支架[6]；還可以翻譯成蛋白或多肽[9]。此外，有一些假基因也來(lái)源于circRNA[10]。但circRNA在牛上的研究主要集中在作為“分子海綿”調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的增殖、分化與凋亡[11-13]，參與牛睪丸發(fā)育和精子發(fā)生[14]，也可能參與酪蛋白基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[15]。之前也有相關(guān)circRNA在奶牛乳腺炎中作用的相關(guān)分析，證明circRNA參與了奶牛乳腺炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

本研究從前期高通量測(cè)序結(jié)果中篩選到一個(gè)名為circRNAcirc0000316的circRNA[16]，并通過(guò)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型，采用RT-PCR方法檢測(cè)circ0000316在該模型中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究環(huán)狀RNA在奶牛乳腺炎進(jìn)程中的作用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 由病理專(zhuān)業(yè)人員將現(xiàn)代牧業(yè)(寶雞牧場(chǎng))中明顯患有乳腺炎病變和泌乳中后期因意外(如發(fā)生骨折等疾病)而淘汰的健康奶牛的乳腺組織取樣送到實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)病理學(xué)鑒別診斷后確定患有乳腺炎，病料經(jīng)40 mL/L福爾馬林及9 g/L生理鹽水處理后，一部分于-80℃保存，一部分用于后期試驗(yàn)。

1.1.2 細(xì)胞和菌種 奶牛乳腺上皮細(xì)胞系(MAC-T細(xì)胞)以及本研究中所用大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 Trizol up試劑盒、TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑，均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；牛腫瘤壞死因子(TNF-α)檢測(cè)試劑盒，上?？道蕦?shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；DMEM/DF12培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，以色列BI公司產(chǎn)品；試驗(yàn)過(guò)程中所用到的引物，均由北京擎科公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.1.4 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；Real-time quantitative PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 組織和細(xì)胞RNA提取 本試驗(yàn)采用Trizol法提取組織總RNA。對(duì)于組織樣品，將黃豆大小的組織樣品剪碎后放入液氮預(yù)冷的研缽中，將組織塊研細(xì)，加入1 mL Trizol up試劑反復(fù)吹吸，使組織樣品充分裂解，依照說(shuō)明書(shū)提取組織或細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)所得RNA質(zhì)量和濃度，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞樣品經(jīng)處理后，棄去上清，經(jīng)PBS沖洗后加入適量Trizol up試劑，使細(xì)胞充分裂解后依據(jù)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)所得RNA質(zhì)量和濃度，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR檢測(cè) 按照北京全式金公司TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)步驟如下：在無(wú)RNase的EP管中，分別加入總RNA 1 μg、Random Primer(N9)和TransScript?RT/RI Enzyme Mix各1 μL，2×TS Reation Mix 10 μL，加Nuclease-Free Water補(bǔ)至20 μL，輕輕混勻后，25℃孵育10 min，42℃孵育15 min，85℃加熱5 s失活TransScript?RT/RI，反應(yīng)結(jié)束后將cDNA置于-20℃?zhèn)溆?。采用SYBR方法檢測(cè)mRNA表達(dá)情況，反應(yīng)體系與步驟如下：在無(wú)RNase的EP管中，分別加入2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-Free Water補(bǔ)至20 μL，輕輕混勻后，進(jìn)行離心，避免管壁和管蓋沾有液體而影響試驗(yàn)結(jié)果，每孔3個(gè)重復(fù)。PCR程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增；95℃ 15 min，60℃ 1 min，±5℃進(jìn)行梯度升溫至95℃，持續(xù)15 s，程序結(jié)束后對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.3 大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌滅活 參照Ma等[17]的試驗(yàn)方法，首先對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，將保存于-80℃的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌分別劃線接種于不含抗生素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃倒置培養(yǎng)14～16 h，待培養(yǎng)基中長(zhǎng)出單菌落，并將1 mm～2 mm的單菌落用接種針接種于15 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，收集菌液備用。將收集后的菌液分別進(jìn)行10倍稀釋至102、104、106后，分別吸取不同稀釋度的菌液10 μL接種至LB固體培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37℃倒置培養(yǎng)12 h～14 h，待培養(yǎng)基長(zhǎng)出清晰可見(jiàn)的單菌落時(shí)，對(duì)單菌落數(shù)在50～200之間的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)，依據(jù)文獻(xiàn)中的計(jì)算公式對(duì)細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將收集后的菌液在超凈臺(tái)中分裝至2 mL無(wú)菌離心管中，做好標(biāo)記并封口。采用低溫滅活的方式對(duì)細(xì)菌進(jìn)行滅活，依據(jù)文獻(xiàn)中的描述，大腸埃希氏菌的滅活條件為：65℃水浴1 h，金黃色葡萄球菌為60℃水浴2 h。滅活后對(duì)菌液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，檢驗(yàn)方法為：吸取10 μL滅活后的菌液，接種至LB固體培養(yǎng)基中倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察培養(yǎng)基中是否長(zhǎng)出單菌落，若未長(zhǎng)出則滅活成功，將滅活成功的單菌落于-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 炎性細(xì)胞模型的建立 將生長(zhǎng)良好的MAC-T細(xì)胞消化收集后，用DF12培養(yǎng)液重懸進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞接種于60皿中，每皿細(xì)胞數(shù)約為4×105個(gè)，培養(yǎng)細(xì)胞至貼壁；將預(yù)先滅活并計(jì)數(shù)的菌液收集離心，PBS清洗2次后細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌分別以1 000∶1和100∶1的比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行攻菌，處理24 h后分別收集上清和細(xì)胞，總RNA進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ①試驗(yàn)前準(zhǔn)備：將試劑盒平衡至室溫后，20倍濃縮洗滌液于37℃水浴助溶；②收集處理后細(xì)胞上清至無(wú)菌離心管，2 500 r/min離心20 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管；③加樣：設(shè)置空白孔，標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，空白孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣品孔中，樣品稀釋液40 μL+待測(cè)樣品10 μL(樣品稀釋5倍)；④加酶孵育：除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，封板膜封板，37℃孵育60 min；⑤洗板：20倍濃縮洗滌液蒸餾水稀釋20倍，揭掉封板膜棄去試劑，甩干，每孔加滿洗滌液(約350 μL)，靜置30 s棄去，重復(fù)5次，拍干；⑥顯色：每孔先加顯色劑A 50 μL，再加50 μL顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，封板37℃避光顯色15 min；⑦終止：每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)；⑧測(cè)定：終止液加入15 min后，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 本研究中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”形式呈現(xiàn)，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由雙尾t檢驗(yàn)所得，*P<0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，**P<0.01認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 circ0000316在健康乳腺組織及炎性乳腺組織中的表達(dá)

本研究前期從現(xiàn)代牧業(yè)(寶雞牧場(chǎng))獲得了3頭健康奶牛和3頭患乳腺炎奶牛的乳腺組織，分別提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)circ0000316的表達(dá)量，結(jié)果顯示circ000316在炎性組織中的表達(dá)量顯著降低(圖1A和圖1B)。

A.炎性組織和正常組織中circ0000316的表達(dá)(n=3)；B.炎性組織和正常組織中circ0000316表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。**P<0.01

2.2 奶牛乳腺炎細(xì)胞模型的建立

參考文獻(xiàn)中建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型的方法，以大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌刺激MAC-T細(xì)胞后，TNF-α顯著升高為作為模型建立成功的標(biāo)志，因此本研究從mRNA和蛋白分泌水平檢測(cè)了TNF-α的變化，結(jié)果顯示TNF-α表達(dá)量顯著升高(圖2A和2B)，表明炎癥模型建立成功。

A.大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌刺激前后TNF-α基因表達(dá)情況；B.大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌刺激后TNF-α分泌水平

2.3 circ0000316在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型中的表達(dá)

在成功建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型后，本研究繼而檢測(cè)了circ0000316在該模型中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，circ0000316在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型中呈現(xiàn)顯著低表達(dá)(圖3)，與前面提到的組織中的表達(dá)情況一致。

圖3 circ0000316在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型中的表達(dá)量

3 討論

本研究參考Ma等[16]的方法以炎性標(biāo)志性因子TNF-α升高為標(biāo)志，建立了大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌刺激的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型，模擬奶牛發(fā)生乳腺炎時(shí)的細(xì)胞環(huán)境，驗(yàn)證circ0000316在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與奶牛乳腺組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致，也與文獻(xiàn)中報(bào)道的高通量測(cè)序結(jié)果中circ0000316的表達(dá)趨勢(shì)相一致[17]。此外，有研究表明，circKIKA通過(guò)miR-326的“分子海綿”作用參與調(diào)控MAC-T細(xì)胞的凋亡和增殖[18]；而circLPP通過(guò)“分子海綿”作用降低游離miR-615的表達(dá)，導(dǎo)致miR-615對(duì)其靶基因SPRED3的穩(wěn)定性降低，從而參與調(diào)控奶牛乳腺組織的炎癥進(jìn)程[19]。

本研究在大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳腺炎模型中驗(yàn)證了circ0000316的表達(dá)情況，為深入研究circ0000316在奶牛乳腺炎發(fā)生過(guò)程的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究奶牛乳腺炎的防控提供了新思路。