李云燦,胡劍武,趙俊龍,李家奎*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院,西藏林芝 860000; 2.西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠,西藏拉薩 850003; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢 430070)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家豬和野豬引起的一種出血性病毒病[1]。ASFV感染豬的臨診表現(xiàn)為呼吸障礙、皮膚以及臟器廣泛出血等，對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，被納入世界動物衛(wèi)生組織(OIE)通報(bào)性疾病名錄中[2]。非洲豬瘟疫情最早可追溯到20世紀(jì)初期。在1921年，Montgomery進(jìn)行了有關(guān)肯尼亞1909年至1915年家豬疫情的系統(tǒng)研究后，發(fā)現(xiàn)此病并首次報(bào)道[3]。隨后，在中非和南非也發(fā)現(xiàn)了這種病毒。1957年在里斯本首次發(fā)現(xiàn)該病，并迅速傳播到歐洲其他國家，美洲國家也受到了ASFV的影響[4]。非洲豬瘟的流行，給這些國家的養(yǎng)殖業(yè)造成了毀滅性的打擊[5]。2018年8月，中國沈陽出現(xiàn)一例疑似疫情，該疫情隨后被權(quán)威部門確診為非洲豬瘟[6]。隨后各省相繼有疫情發(fā)生，疫情范圍持續(xù)擴(kuò)大。2019年4月，中國農(nóng)業(yè)和農(nóng)村部發(fā)布通知，中國西藏地域發(fā)現(xiàn)了該類疫情，危害的地區(qū)主要集中在林芝市及周邊區(qū)域。林芝地區(qū)是我國藏豬的主要產(chǎn)區(qū)，藏豬是該地獨(dú)有的高海拔地方性品種豬。由于藏豬傳統(tǒng)的放牧飼養(yǎng)方法，導(dǎo)致疾病易于傳播，非洲豬瘟的流行給當(dāng)?shù)夭刎i養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失[7]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是現(xiàn)階段檢測方法中最成熟的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[8]。因此，建立一種針對非洲豬瘟病毒的快速PCR檢測方法對于預(yù)防和診斷非洲豬瘟具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 VP72基因片段，武漢生工生物工程有限公司提供；用于特異性試驗(yàn)的病毒：經(jīng)典豬瘟病毒(CSFV,疫苗C株)，廣東永順生物技術(shù)有限公司提供；豬偽狂犬病病毒(PRV,HB-98株)，武漢科前生物股份有限公司提供；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2,LG疫苗株)、豬細(xì)小病毒(PPV,N疫苗株)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV,疫苗CV777株)、輪狀病毒(RV,疫苗NX株)，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司提供。

1.1.2 試劑 2×EasyTaqPCR Super Mix(dye)、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；dNTP、Taq?酶及反應(yīng)緩沖液，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，天根生化科技北京有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；溴化乙錠(EB)，美國Sigma公司產(chǎn)品；瓊脂糖，英國Oxoid公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 恒溫雙列四孔型恒溫水浴鍋(DK-98-ⅡA)，天津泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；臺式冷凍離心機(jī)(CT15RE)，日立公司產(chǎn)品；生物安全柜(BSC-1100-LⅡB2)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；PCR儀(TC-XP)，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；雙穩(wěn)定時電泳儀電源(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(1600/1600R)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)參照GenBank上公布的非洲豬瘟病毒(ASFV)VP72基因序列，使用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)檢測ASFV的PCR引物。ASFV-539F：ATGCCGATACCACAAGAT；ASFV-539R：TAACCACCACGATGAAAA，目的片段長度539 bp。OIE推薦的ASFV PCR引物序列為，OIE-F：ATGGATACCGAGGGAATAGC；OIE-R：CTTACCGATGAAAATGATAC，目的片段長度278 bp[9]。引物均由武漢生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 方法的建立 以合成的VP72基因片段作為陽性對照，建立PCR方法，反應(yīng)體系(25 μL)如下：2×EasyTaqPCR Super Mix(dye)13 μL，ddH2O 8 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃后延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖中進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)凝膠圖像分析系統(tǒng)顯示的目的條帶判斷。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書分別提取經(jīng)典豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒等疫苗的核酸，并通過反轉(zhuǎn)錄的方法得到經(jīng)典豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒的cDNA。隨后進(jìn)行本試驗(yàn)引物和OIE引物的特異性反應(yīng)。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 以合成的VP72基因片段作為模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，共設(shè)15個梯度。使用本試驗(yàn)引物和OIE推薦引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

按照方法1.2.3進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示兩種引物在特異性方面均表現(xiàn)良好，只有合成的VP72基因片段呈現(xiàn)目的條帶，如圖1(A、B)所示。

A.本試驗(yàn)設(shè)計(jì)引物; B.OIE推薦引物; M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.經(jīng)典豬瘟病毒; 2.豬流行性腹瀉病毒; 3.輪狀病毒; 4.偽狂犬病病毒; 5.豬圓環(huán)Ⅱ型病毒; 6.豬細(xì)小病毒; 7.陽性; 8.陰性

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

兩對引物敏感性試驗(yàn)的凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2(A、B)所示，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物和OIE推薦引物PCR最低檢測限分別達(dá)到10-8和10-7。兩對引物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物比OIE推薦使用的引物敏感性高10倍。

A.本試驗(yàn)設(shè)計(jì)引物; B.OIE推薦引物; M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～15.以合成的VP72基因片段為模板10倍梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15; 16.陰性對照; 17.陽性對照

3 討論

中國出現(xiàn)非洲豬瘟以來，該病對中國的豬養(yǎng)殖業(yè)造成了致命性打擊。雖然疫情是突然發(fā)生的，但中國相關(guān)部門也迅速制定并實(shí)施了相應(yīng)的應(yīng)急措施。截止2019年初，非洲豬瘟疫情在中國共計(jì)發(fā)生98起，發(fā)病范圍涵蓋23個省(直轄市)區(qū)。2019年4月，西藏自治區(qū)首次發(fā)生?，F(xiàn)階段疫情發(fā)生規(guī)模和形勢而言，疫情依然呈現(xiàn)零星、散發(fā)態(tài)勢[10-11]。畜牧業(yè)是西藏重要的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)之一，但當(dāng)前該產(chǎn)業(yè)受到了非洲豬瘟流行的嚴(yán)重威脅和挑戰(zhàn)，如何對非洲豬瘟進(jìn)行防控以及快速檢測非洲豬瘟病毒，并采取合理的措施是非常重要的。

目前檢測非洲豬瘟病毒的方法有細(xì)胞接種、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時定量PCR(real-time PCR)等。由于ASFV不易在常規(guī)細(xì)胞上生長，同時還存在著散毒的隱患。ELISA用于檢測其抗體水平的高低，不能用于ASF的確診。LAMP操作簡單且靈敏性高，但易形成氣溶膠污染，其假陽性問題較為嚴(yán)重。而real-time PCR容易出現(xiàn)污染且成本較高。PCR方法普遍用于診斷多種動物疫病，特別對于診斷中、低毒力感染或慢性病例非常有用，是早期診斷的首選[12-13]。早在20世紀(jì)90年代初，Steiger等就選取非洲豬瘟病毒基因序列的保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物，用于ASFV的特異性檢測。盡管該方法在檢測紅細(xì)胞樣品時容易出現(xiàn)非特異性DNA帶，但PCR檢測ASFV所表現(xiàn)出來的靈敏、快速和簡便的特性，顯著地好于一些常規(guī)的檢測方法。

King D P等[9]和Aguero M等[14]建立了非洲豬瘟病毒的PCR檢測方法，后來該方法被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)采用。此后，國內(nèi)外的很多學(xué)者陸續(xù)發(fā)表關(guān)于非洲豬瘟病毒PCR方法建立的論文[15-16]。本試驗(yàn)以VP72基因序列為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)PCR引物用于特異性檢測非洲豬瘟病毒，并進(jìn)行特異性及敏感性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR檢測引物檢測豬常見病毒均無交叉反應(yīng)，特異性良好，同時引物敏感性可達(dá)到10-8。而OIE推薦使用引物PCR最低檢測限為10-7，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR引物敏感性比OIE推薦引物高出10倍。在非洲豬瘟盛行的情況下，要想在最短的時間內(nèi)根除病原，就必須及早地通過診斷來發(fā)現(xiàn)疫情。ASF診斷是為了預(yù)防疾病的傳播，增強(qiáng)PCR方法的敏感性對環(huán)境樣品和潛伏期病毒的檢測十分重要。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR引物在非洲豬瘟病毒的臨床檢測和早期預(yù)警中具有更大的優(yōu)勢，為非洲豬瘟的預(yù)防和控制提供了一種更靈敏的診斷方法，值得在生豬生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。