袁景麗，鄭紅麗，梁先利，梅俊，余東亮，孫玉強，柯麗萍

花青素代謝對陸地棉葉片和纖維色澤呈現(xiàn)的影響

袁景麗，鄭紅麗，梁先利，梅俊，余東亮，孫玉強，柯麗萍

浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院/植物基因組與彩色纖維分子改良實驗室，杭州 310018

【】棉花作為一種重要的經(jīng)濟作物和油料作物，其葉片和纖維均可積累色素物質，呈現(xiàn)不同顏色。葉綠素、類胡蘿卜素和花青素的含量及其比例是棉花葉片呈色的主要原因，而棕色纖維中主要色素成分為花青素單體氧化聚合而成的原花青素及其衍生物。通過分析陸地棉不同的葉色突變體葉片和纖維中的花青素含量，花青素和原花青素合成途徑中關鍵基因的表達，探究棉花葉片和纖維顏色呈現(xiàn)與花青素合成的關系，為葉色突變體的利用和彩色棉纖維色澤的改良奠定基礎。通過測定21個陸地棉葉色突變體的葉片花青素含量，根據(jù)葉色突變體葉片、纖維顏色和花青素含量差異，篩選了其中6個典型的棉花葉色突變體作為研究材料，比較葉片和纖維（開花后15 d）中的花青素含量，分析花青素含量與葉片、纖維顏色呈現(xiàn)的關系；同時檢測葉片及不同發(fā)育時期纖維（開花后5、10、15和20 d）中花青素合成關鍵基因和原花青素合成途徑關鍵基因和的表達水平，分析目標基因對葉片和纖維顏色呈現(xiàn)的影響。21個陸地棉葉色突變體葉片中的花青素含量差異顯著，呈現(xiàn)紫紅色或紫色的葉片花青素含量高。在篩選的6個陸地棉葉色突變體及其對照葉片和不同發(fā)育時期纖維中，葉片花青素含量顯著高于纖維，棕色纖維的花青素含量顯著高于白色纖維。葉片中，表達量較高，而和表達量較低，花青素積累與顏色呈現(xiàn)與其表達量沒有顯著的相關性；而在纖維中，和在棕色纖維的表達量極顯著高于白色纖維中，且主要集中在纖維發(fā)育的5—15 DPA高表達。陸地棉葉片和纖維的顏色呈現(xiàn)均與花青素含量有關，紫色及紫紅色葉片以及棕色纖維中花青素含量高，但纖維顏色的形成與棉花葉片顏色呈現(xiàn)沒有顯著的相關性，其花青素含量與原花青素合成途徑的關鍵基因和表達水平直接相關，表明棉花葉片和纖維中的呈色機制不一致，原花青素主要在纖維中積累顯色。

陸地棉；葉色突變體；纖維色澤；花青素；基因表達

0 引言

【研究意義】棉花是中國重要經(jīng)濟作物和油料作物之一，也是人們生活必需品的重要紡織原料。因為天然彩色棉纖維腔中富含天然色素而呈現(xiàn)色彩，所以可以直接紡紗成衣，無需化學印染，而且制品無污染、純天然，和皮膚親和性好，呵護皮膚健康，符合大眾對于健康、環(huán)保的要求，具有廣闊的發(fā)展前景。但是彩色棉的纖維品質較差、顏色種類少（只有綠色和棕色）、色牢度不穩(wěn)等因素限制了彩色棉產品的開發(fā)。為了滿足消費市場需求，培育出更多色系的彩色棉顯得尤為重要。因此，解析陸地棉葉片和纖維中花青素生物合成調控及呈色機理，對進一步培育出更多顏色類型彩色棉品種具有重要意義。【前人研究進展】葉綠素、類胡蘿卜素和花青素廣泛存在于植物的葉片、花朵、莖稈、根以及果實中[1-3]，三者之間的比例和含量是植物呈現(xiàn)色彩的主要原因?；ㄇ嗨厥且环N水溶性色素，主要以糖苷形式存在，能形成紅色和藍色等多種顏色，在植物的生長、發(fā)育和防御中起重要作用[4-7]。花青素生物合成途徑及調控網(wǎng)絡一直是研究的重點和熱點，目前，已對擬南芥（）、蕪菁（L.）、葡萄（L.）、菊花（）和蘋果（Mill）等[8-14]多種植物的花青素合成途徑進行了深入研究，在不同植物中，花青素代謝基因可分為結構基因和調節(jié)基因。根據(jù)其在花青素合成途徑中的位置和作用，結構基因又可分為上游合成基因（包括（phenylalanine ammonialyase）、（chalcone synthase）、（chalconesynthase）、（flavanone-3’ -hydroxylase）、（flavanone-3’5’-hydroxylase）等）和下游合成基因（包括（dihydroflavonol 4 reductase）、（anthocyanidin synthase）、（flavonoid- 3-O-glycosyltransferase）、（O-methyltransferase）等）。其中，是類黃酮合成途徑中的第一個關鍵酶，它催化丙二酰輔酶A的3個乙酸基和對羥基苯丙烯酰輔酶A的一個乙酸基縮合生成柚苷配基查爾酮，參與植物逆境反應和植物花色等諸多過程[15-16]。位于下游的原花青素特異性途徑涉及2條支路和2種酶，即無色花青素還原酶（leucoanthocyanin reductase，LAR）參與的LAR途徑和花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）參與的ANR途徑。最早在銀葉山螞蝗（(Jacs) DC）中被克隆獲得，LAR是植物類黃酮化合物合成路徑中一個關鍵酶，它可以催化無色花青素轉化成為兒茶素[17-18]。ANR負責將有色花青素還原成表兒茶素，參與調控植物組織中花青素的水平及原花青素的形成，在花青素積累過程中具有重要的調節(jié)作用[19-20]。雖然天然彩色棉纖維色素的具體組分還未明確，但LIU等[21]研究證實天然彩棉纖維色素成分與植物類黃酮合成途徑密切相關，并且類黃酮生物合成途徑調控棕色棉色素沉積過程。Xiao等[22]和郭帥等[23]從棕色棉中克隆了花青素合成相關結構基因，并發(fā)現(xiàn)基因的表達量在棕色棉纖維中明顯高于白色棉纖維；Feng等[24]研究證實棕色棉中的色素類物質為原花青素，纖維顏色的呈現(xiàn)與原花青素的氧化聚合有關。而綠色棉纖維色素最早被認為其中含有有機酸、甾醇、香豆素和黃酮類物質，隨后發(fā)現(xiàn)苯乙烯酸及其衍生物是綠色棉纖維產生顏色的重要因素[25-28]?！颈狙芯壳腥朦c】花青素生物合成途徑及調控因子是彩色葉片和果蔬色澤形成研究的重點和熱點，在陸地棉中葉片和纖維的顏色呈現(xiàn)都與植物類黃酮合成途徑密切相關，但棉纖維色素物質的合成代謝及其轉運機理研究甚少。【擬解決的關鍵問題】本研究利用收集到的陸地棉21種葉色突變體及白色纖維棉和棕色纖維棉為材料，通過比較不同顏色葉片和纖維中花青素含量，分析花青素和原花青素合成通路關鍵酶基因、、的表達水平對葉色和纖維色澤的影響，探究陸地棉葉片和纖維呈色與花青素積累的關系及其分子調控水平的差異，為培育出更多顏色類型彩色棉品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用20份陸地棉葉色突變體由國家棉花種質資源中期庫和國家棉花種質資源平臺提供（表1）。紫化突變體、C312和棕絮1號（ZX1）由浙江理工大學植物基因組與彩色纖維分子改良實驗室保存。試驗材料于2017—2020年種植在浙江理工大學棉花試驗地（浙江杭州下沙校區(qū)），按照大田常規(guī)栽培管理。采集幼葉及5、10、15和20 DPA（day post anthesis，開花后天數(shù)）纖維，3個生物學重復，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 花青素的提取

采集陸地棉葉色突變體的新生葉片和纖維（15 DPA）于液氮中速凍，放于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用酸化甲醇法[29]測定花青素含量。

表1 試驗材料

綠/紫（紅）：表示夏季葉片呈綠色，秋天呈紫（紅）色；黃/綠：表示苗期葉片呈黃色，后期葉片呈綠色

Green/Purple (Red): indicates leaves showed green in summer and purple (red) in autumn; Yellow/Green: indicates leaves in young seedlings showed yellow and turned green in autumn

1.3 RNA提取及cDNA的合成

采集葉色突變體幼葉及5、10、15和20 DPA（day post anthesis，開花后天數(shù)）纖維，按照多糖多酚植物RNA提取試劑盒說明書進行RNA提取，并將RNA濃度稀釋到200 ng·μL-1，參照反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，以泛素延伸蛋白7（ubiquitin extension protein 7，GhUBQ7）基因為內參基因，進行PCR擴增，檢測其純度。最終將cDNA稀釋10倍后于-20℃保存。

1.4 實時熒光定量PCR

根據(jù)前期工作中在陸地棉葉片和纖維中優(yōu)勢表達的基因序列[30]，在NCBI和COTTONGEN中搜索、和的CDS序列，用Primer Express 5.0設計目的基因、和所需引物（表2）。

以陸地棉葉色突變體幼葉、不同發(fā)育時期纖維cDNA為模板，以陸地棉泛素延伸蛋白7基因（）為內參基因，利用QuantStudio 3 applied biosystem，按照Solarbio SYBR green Mix說明書進行實時熒光定量PCR擴增。反應條件為95℃2 min；95℃15 s，58℃30 s，40個循環(huán)。熔解曲線95℃15 s，60℃15 s。生物學重復和技術重復各3次。按照2-ΔΔCt方法計算相對表達量，用Graphpad Prism 5繪圖。

表2 引物序列及用途

：查爾酮合成酶；：無色花青素還原酶；：花青素還原酶；：泛素延伸蛋白。下同

: Chalcone synthase;: Leucoanthocyanidin reductase;: Anthocyanidin reductase;: Ubiquitin extension protein. The same as below

2 結果

2.1 陸地棉葉色突變體葉片花青素含量分析

通過對陸地棉不同葉色突變體花青素的提取，發(fā)現(xiàn)提取液顏色差異顯著（圖1），黃色葉片的芽黃棉1號提取液呈淺黃色；紅紫色葉片的紅葉白絮、矮紅株、紅雞腳柳苞棉、貴池紅葉、以及紅色葉片的送興紅葉B、紅葉雞腳、安徽紅桃棉、抗紅葉提取液呈現(xiàn)出不同深淺的紅色、褐色、紅褐色。陸地棉葉色突變體葉色呈紅色或紅紫色，其葉片花青素提取液色澤較深。

通過對陸地棉葉色突變體花青素提取液進行500—700 nm的波段掃描（圖2），不同陸地棉葉色突變體花青素提取液均在530、620和650 nm處呈現(xiàn)吸收高峰。530 nm是花青素酸性溶液的吸收高峰，620 nm是可溶性糖的吸收高峰，650 nm是葉綠素的吸收高峰，表明不同陸地棉葉色突變體在500—700 nm所含的物質相同，但不同陸地棉葉色突變體之間的吸光值呈現(xiàn)差異。

通過比較不同陸地棉葉色突變體葉片的花青素含量（圖3），以陸地棉C312為對照，安徽紅桃棉的花青素含量略低；石河子822、錦9-70、紫花棉、小紅葉等的花青素含量無顯著差異；送興紅葉B、紅雞腳柳苞棉、抗紅葉、紅葉花苞棉、花斑葉、紅雞腳柳苞、貴池紅葉、等的花青素含量均顯著高于陸地棉C312。

2.2 陸地棉葉色突變體纖維花青素含量分析

為了研究花青素合成相關基因表達與花青素含量及葉片和纖維顏色呈現(xiàn)的關系，根據(jù)葉色突變體葉片、纖維顏色和花青素含量選取了6個突變體，包括葉片呈紫色且花青素含量較高的貴池紅葉和矮紅株，葉片為綠色且花青素含量與對照C312持平的紅槿矮和棕色纖維的紫花棉，葉色為紫紅但花青素含量較低的安徽紅桃棉，及花青素大量累積的紫葉突變株，測定其纖維（15 DPA）中的花青素含量以及葉片和纖維中、和的相對表達量。6個葉色突變體的葉片和纖維顏色如圖4所示。

樣本編號同表1。下同 The sample ID is the same as table 1. The same as below

依據(jù)光波長530 nm處吸收峰值自上向下的順序為：20、21、17、13、7、1、4、15、10、19、11、3、2、18、12、14、6、16、5、9、8

測定6個陸地棉葉色突變體和白絮對照C312 及棕絮對照棕絮1號（ZX1）15 DPA纖維中的花青素含量（圖5），結果顯示，所有材料中，葉片花青素含量在0.5—40 nmol·g-1，而纖維花青素含量只有0.1—0.8 nmol·g-1，纖維中花青素含量都明顯低于葉片。葉片中，呈紫紅色的貴池紅葉、矮紅株和中花青素含量略高，顯著高于C312；纖維中，棕色纖維的紫花棉和棕絮1號的花青素含量極顯著高于白色纖維的C312和其他葉色突變體；但不同葉色突變體中葉片與纖維中的花青素含量沒有顯著相關性，如葉片中花青素含量較高的貴池紅葉，其纖維花青素含量極低，顯著低于棕絮1號和紫花棉；而葉片花青素較低的紫花棉，其纖維花青素含量極顯著高于C312。

2.3 陸地棉葉色突變體葉片GhCHS、GhLAR和GhANR的表達分析

通過分析3個花青素通路關鍵酶基因查爾酮合成酶（）、花青素還原酶基因（）和無色花青素還原酶基因（）在6個陸地棉葉色突變體中的表達，發(fā)現(xiàn)3個基因的表達水平各不相同（圖6）。在紅槿矮和中表達水平顯著高于C312；和在不同葉色突變體的葉片中表達量普遍較低，除安徽紅桃棉、矮紅株和貴池紅葉中表達量顯著低于C312外，在其他突變體中，這兩個基因的表達變化不顯著。而且，在各棉花葉色突變體的葉片中，的表達水平顯著高于和。

顯著性分析均以C312為對照，星號表示具有顯著性差異（*P＜0.05，**P＜0.01）。下同

A：葉色突變體的葉片表型；B：葉色突變體的纖維表型

2.4 陸地棉葉色突變體不同發(fā)育時期纖維GhCHS、GhLAR和GhANR的表達分析

通過對6個陸地棉葉色突變體不同發(fā)育時期纖維中的3個基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)、和均在發(fā)育5、10和15 DPA的纖維中表達量較高，棕色纖維與白色纖維之間的表達差異較大（圖7）。其中，在葉色突變體和棕絮1號5—10 DPA纖維中的表達均顯著高于對照C312，在、HT和ZX1的15 DPA纖維中仍保持較高表達量；而在20 DPA左右纖維中，所有葉色突變體和對照中表達量都降至極低水平。在白色纖維的葉色突變體中，和在10 DPA纖維中的表達量均顯著高于C312；棕色纖維的棕絮1號在5—15 DPA纖維中，和的表達量均顯著高于C312，而紫花棉中3個基因都集中在5 DPA纖維中高表達。

A：葉色突變體的葉片花青素含量；B：葉色突變體的纖維花青素含量

圖6 GhCHS、GhLAR和GhANR在陸地棉葉色突變體葉片中的表達

3 討論

葉片是植物主要的光合作用器官，含有大量葉綠素使其呈綠色，葉片隨色素種類及比例的變化而呈現(xiàn)不同色彩。植物中除了葉綠素外，還含有花青素、類胡蘿卜素等，使植物莖、葉、花、果實及種子等組織呈現(xiàn)五彩繽紛的色彩[31]。自然界中常見的花青素有6種，分別為天竺葵色素（pelargonidin，Pg）、矢車菊色素（cyanidin，Cy）、飛燕草色素（delphindin，Dp）、芍藥色素（peonidin，Pn）、錦葵色素（malvidin，Mv）和矮牽牛色素（petunidin，Pt）[32-33]，而棕色棉纖維中主要色素成分為原矢車菊素和原飛燕草色素[24]。為了探究花青素代謝與陸地棉葉色突變體表型之間的關系，本研究提取21種陸地棉葉色突變體幼葉花青素進行分析。不同陸地棉葉色突變體的花青素提取液呈現(xiàn)出色澤差異。黃色葉片的芽黃棉1號花青素提取液色澤呈現(xiàn)黃色，紫色或紅色葉色的陸地棉葉色突變體葉片花青素提取液色澤呈現(xiàn)深紅色、紅褐色，表明花青素提取液色澤與葉片顏色基本一致。測定葉片花青素含量，發(fā)現(xiàn)葉片為紫色或紅色的陸地棉葉色突變體花青素含量高，與吳華玲等發(fā)現(xiàn)茶樹芽葉花青素含量較高時能使茶樹嫩葉呈現(xiàn)紫色、紅色或紫紅色結果相一致[34]。葉色突變體中，花青素含量差異較大，除斑葉棉、安徽紅桃棉、錦9-70、石河子822、芽黃棉1號外，其他突變體中花青素含量都顯著高于綠葉的陸地棉C312。其中，芽黃棉1號葉綠素和花青素含量都較低，其葉片顏色應該是由類胡蘿卜素呈色所致。矮紅株、紅葉雞腳、紅槿矮夏葉呈綠色，秋葉呈紫色，可能是由于光照、溫度等刺激花青素合成，也有可能是秋季葉綠素開始降解，導致植物內色素比例發(fā)生改變[35]。

圖7 不同陸地棉葉色突變體不同發(fā)育時期纖維中GhCHS、GhLAR和GhANR的表達

通過對6個突變體15 DPA纖維的花青素含量分析顯示，纖維中花青素含量顯著低于葉片中；白色纖維中雖然沒有顏色呈現(xiàn)，但仍然能檢測到花青素存在，只是含量顯著低于棕色纖維，與Feng等[36]研究棕色棉纖維中柑橘素、槲皮素、山奈酚和楊梅素4種黃酮類化合物的積累量明顯高于白色棉纖維中這一結果相一致。

為了進一步研究花青素代謝對陸地棉葉片和纖維呈色的影響，本研究分析了6個陸地棉葉色突變體中、和在葉片和纖維中的表達變化。在葉片中，表達量較高，而和在葉片中表達量較低，花青素積累與顏色呈現(xiàn)與其表達量沒有顯著的相關性。而在纖維中，和在棕色纖維的表達量極顯著高于白色纖維中，且主要集中在纖維發(fā)育的5—15 DPA高表達，表明二者可以促進纖維花青素的合成，且纖維發(fā)育早期是色澤形成的重要時期。前期對、和的病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）干涉，已經(jīng)證實3個基因表達量的降低可以不同程度地使棕色棉纖維色澤變淺[30]，本研究進一步證實，、和主要參與纖維顏色的形成，對葉片花青素含量和葉片顏色呈現(xiàn)影響不大，由此推測葉片顏色和纖維色澤的形成之間沒有顯著的相關性。

4 結論

陸地棉葉片和纖維中顏色呈現(xiàn)都與花青素含量相關，紫色及紫紅色葉片以及棕色纖維中花青素含量高，但纖維顏色的形成與棉花葉片顏色呈現(xiàn)沒有顯著的相關性，其花青素含量與原花青素合成途徑的關鍵基因和表達水平直接相關，表明棉花葉片和纖維中的呈色機制不完全一致，原花青素主要在纖維中積累顯色。

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Influence of anthocyanin biosynthesis on leaf and fiber color ofL.

Yuan Jingli, Zheng Hongli, Liang Xianli, Mei Jun, Yu Dongliang, Sun Yuqiang, Ke Liping

School of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University/Plant Genomics & Molecular Improvement of Colored Fiber Lab, Hangzhou 310018

【】Cotton is an important economic and oil crop. Both its leaves and fibers can accumulate pigments and present different colors. Studies have confirmed that chlorophyll, carotenoids, and anthocyanin are the main pigments in cotton leaves and their relative proportion changes leaf colors. While proanthocyanidins and their derivatives, which are oligomeric and polymeric products from anthocyanidins, are thought to be responsible for the color formation of brown fibers. This article intends to explore the relationship between the color of leaves and fibers in upland cotton through analyzing the anthocyanidin content and gene expression level in the anthocyanin biosynthesis pathway in different leaf color mutants. The result will help to lay the foundation for the utilization of leaf color mutants and the improvement of the color of colored cotton fibers.【】In this experiment, the anthocyanidin contents in leaves of 21 upland cotton leaf color mutants were detected. According to the leaf and fiber color as well as the anthocyanidin content level, 6 cotton leaf color mutants were selected as materials to measure the anthocyanidin level in leaves and fibers at 15 days post anthesis to analyze the relationship between anthocyanidin content and the leaf or fiber color. Then the expression levels of,andin leaves and fibers at different developmental stages (5, 10, 15, 20 DPA) were measured to analyze the influence of target genes on the color formation of leaves and fibers.【】The anthocyanidin content in the leaves of 21 leaf color mutants ofwas significantly different, and the purple or fuchsia leaves had higher anthocyanidin content. In the selected six leaf color mutants, the anthocyanidin content in leaves was significantly higher than that in fibers, and brown fibers accumulated more anthocyanidins than white fibers. Compared to,andexpressed at a very low level in leaves, and no significant correlation was found between leaf color and their expression level. While in fibers, the expressions ofandwere obviously higher in brown fibers than in white fibers, especially in fibers of 5 DPA to 15 DPA.【】Anthocyanins played important roles in color formation of both leaves and fibers in upland cotton. Purple-red or purple leaves and brown fibers accumulated more anthocyanidins, while the formation of fiber color did not directly correlate with leaf color. In fibers, the contents of anthocyanidins directly related to the expression levels ofand, indicating that coloration mechanism of cotton leaves and fibers was not exactly the same, and proanthocyanidins mainly accumulated in fibers.

L.; leaf color mutant; fiber color; anthocyanin; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.003

2020-10-04；

2020-12-25

國家自然科學基金（U1903204，31671738）、浙江省自然科學基金（LZ21C130004）

袁景麗，E-mail：yuanjingli2017@126.com。通信作者柯麗萍，Tel：0571-86843335；E-mail：keliping@zstu.edu.cn

（責任編輯 李莉）