尚曉金，榮小軍，王印庚，汪文俊，劉福利，廖梅杰，張 正，李 彬，于永翔

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業(yè)農村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東青島 266071；3.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東青島 266237）

條斑紫菜（Pyropiayezoensis），屬紅藻門（Rhodophyta），原紅藻綱（Protofllorideae），紅毛菜科（Bangiaceae），紫菜屬，是大型海藻的代表性物種之一，其外觀呈鮮紫紅色或淺紫色，形狀呈卵形、長卵形或裂片［1］。條斑紫菜主要分布于亞洲溫帶海區(qū)，是我國長江以北主要養(yǎng)殖藻類［2］。2017年我國紫菜產量達到17.33萬t，養(yǎng)殖面積約8萬hm2，養(yǎng)殖產量、規(guī)模居世界第一［3］。條斑紫菜富含蛋白質、鈣、磷等，除了具有極高的食用和營養(yǎng)價值之外，在醫(yī)藥衛(wèi)生領域也有廣泛的應用，可制成中藥食用，具有清熱化痰、補腎養(yǎng)心等功效；紫菜中含有的甘露醇是治療水腫的優(yōu)質輔助成份，因此，條斑紫菜被譽為“長壽菜”、“神仙菜”［4］。

近年來，隨著大型藻類養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大、近海養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，藻類病害的發(fā)生日益頻繁［5］。條斑紫菜養(yǎng)殖周期中常見疾病有綠斑病、赤腐病、壺狀菌病、擬油壺菌病、絲狀細菌病、癌腫病、縮曲癥、黃斑病和色圈病等，其病原多為細菌或真菌。其中，條斑紫菜絲狀體育苗期黃斑病的傳染力強、傳播速度快，是危害條斑紫菜育苗的重要疾病之一［5］。本課題組開展的流行病學調查顯示，條斑紫菜黃斑病的發(fā)病時間集中在每年8～10月份，黃斑病發(fā)病初期絲狀體附著物表面出現(xiàn)針頭大小的青黃色斑點，隨著感染加重，斑點逐漸擴大并形成不規(guī)則的黃色斑塊，感染嚴重的絲狀體顏色由黃變白直至死亡。

2018年9月，山東省日照市嵐山區(qū)藻類養(yǎng)殖合作社某紫菜育苗場的條斑紫菜絲狀體暴發(fā)了典型的黃斑病，發(fā)病率高達90%。本研究分離、鑒定了導致該病的一株致病菌，以期為條斑紫菜絲狀體黃斑病的病原菌鑒定及其防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

患病條斑紫菜絲狀體采自山東省日照市嵐山區(qū)藻類養(yǎng)殖合作社某紫菜育苗場，發(fā)病時水溫24～26℃，選取黃色病斑明顯的絲狀體附著物牡蠣殼和些許海水一起放置在無菌自封袋中，常溫保存后運回實驗室，于24 h之內進行處理分析。

1.2 樣品培養(yǎng)

用于感染實驗的健康條斑紫菜絲狀體樣本采自同一育苗場，暫養(yǎng)于70 cm×60 cm×40 cm水族箱內7 d。暫養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度20℃，光照1 000～1 500 lx，光暗周期L∶D＝12∶12，營養(yǎng)溶液中N、P濃度為NO3--N濃度15 mg·kg-1和PO43--P濃度4 mg·kg-1，每隔3 d更換1次過濾海水，實驗用海水經黑暗沉淀紫外消毒殺菌后使用［6］。

1.3 試劑與儀器

柏蘭尼液：（10%硝酸；85%～95%酒精；0.5%鉻酸）、實驗用培養(yǎng)基TSB、TCBS、2216E購自青島生物科技有限公司；生化反應微量鑒定管購自青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；藥敏紙片購自杭州生物試劑有限公司；PCR試劑、引物均購自青島生物工程技術服務有限公司；LAC-450HPY-2型豪華人工氣候箱（上海龍躍）；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡。

1.4 病原菌的分離純化

取無菌海水沖洗患病條斑紫菜絲狀體附著物貝殼樣本表面以去除表面雜質，隨后在無菌操作條件下用解剖工具在有患病明顯的附著貝殼表面刮取病灶部位藻體，刮取面積約為3 cm×3 cm。將刮取物一部分用來制作水浸片，觀察藻體結構變化；另外一部分放置在1.0 mL無菌海水中吹打均勻后進行10倍梯度稀釋，從每個稀釋度藻懸浮液（106CFU·mL-1、107CFU·mL-1、108CFU·mL-1）中吸取100μL，分別接種于TSB、TCBS和2216E培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱（28℃）中培養(yǎng)36 h。觀察菌落生長情況，平板計數(shù)，確定優(yōu)勢菌，將其編號為PZ201809121102。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌株在新鮮培養(yǎng)基上進行分離純化，觀察菌落形態(tài)。將分離純化后的菌株重懸于20%甘油內，-80℃冰箱保存。

1.5 革蘭氏染色與電鏡負染

將菌株PZ201809121102平板劃線后，挑取純化完成的優(yōu)勢菌單菌落，對其進行革蘭氏染色，具體操作方法參照索萊寶革蘭氏染色試劑盒產品說明書，染色完成后在光學顯微鏡下觀察其細菌屬性。用2.5%戊二醛固定液固定后，送至青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院電鏡檢測中心進行細菌形態(tài)檢測，通過透射電鏡觀察分析細菌形態(tài)特征。

1.6 回歸感染實驗

挑取優(yōu)勢菌PZ201809121102在2216E培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)24 h，刮取純化后的優(yōu)勢菌菌落，重懸于2216E液體培養(yǎng)基中，根據淺黃假單胞菌（Pseudomonasluteola）的培養(yǎng)條件，在37℃搖床過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液12 000 r·min-1離心3 min，收集菌體。采用吸光度檢測（OD≈2）和平板計數(shù)法，用滅菌海水將菌株配制成最終濃度為108CFU·mL-1的菌懸液，10倍濃度梯度稀釋法稀釋后為人工回歸感染實驗備用。實驗設置6個濃度組（103CFU·mL-1、104CFU·mL-1、105CFU·mL-1、106CFU·mL-1、107CFU·mL-1、108CFU·mL-1），每個濃度設3個平行組，采用浸浴方式對暫養(yǎng)的健康條斑紫菜絲狀體進行感染實驗，步驟如下：取每個濃度梯度的500 mL菌懸液分裝至1 000 mL錐形瓶中，挑選健康的紫菜附著物貝殼樣本2～3片（每片長3～4 cm、寬2～3 cm）放入錐形瓶中，設置不加菌液的滅菌海水健康條斑紫菜為空白對照組。放置于人工光照培養(yǎng)箱中實驗｛溫度：［20±（1～2）］℃；光強：1 000～1 500 lx；光周期：L／D＝12 h／12 h；營養(yǎng)鹽：NO3--N濃度15mg·kg-1和PO43--P濃度4mg·kg-1｝。實驗期間每2 d更換一次海水，每次更換原海水體積的1／2（更換海水的同時補充營養(yǎng)鹽和菌懸液，保持培養(yǎng)環(huán)境的相對穩(wěn)定）。每日觀察，并記錄生長情況。發(fā)現(xiàn)試驗組樣本表面出現(xiàn)典型的黃色斑點癥狀時，刮取病斑部位進行細菌再分離鑒定，同時，將出現(xiàn)黃色病斑的試驗組與對照組同步取樣，在無菌條件下常規(guī)制片，放在顯微鏡下觀察病變情況。

1.7 16S rDNA鑒定

1.7.1 基因組DNA的制備

用移液槍吸取50μL無菌去離子水，挑取平板劃線后的病原菌單菌落，隨后在100℃水浴儀器中水浴10 min，12 000 r·min-1條件下離心3 min，靜置30 s，取上清液做為PCR反應的模板DNA［7］。

1.7.2 PCR擴增與測序

16S rDNA擴增引物：正向引物，27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTGGCTCAG-3′）；反向引物1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。模板是分離菌株的基因組DNA，按PCR反應體系（50μL）進行特異性擴增。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃復性40 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸20 min，4℃保存。

凝膠檢測成功的PCR產物送至青島生物工程技術服務有限公司進行測序，序列片段在GenBank中用BLAST（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast）進行序列同源性比對，并收集下載與該菌株同屬且相似度較高的菌株序列信息作為參照，使用MEGA 6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 菌株的生理生化特性鑒定

取優(yōu)勢菌PZ201809121102平板劃線，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢單一優(yōu)勢菌落，制成108CFU·mL-1菌懸液，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（第九版）［8］用常規(guī)生理生化試劑盒（青島海博生物技術有限公司）對病原菌進行生理生化特性鑒定。

1.9 藥物敏感實驗

在2216E新鮮固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)優(yōu)勢菌PZ201809121102。24 h后，挑取單菌落置于1.5%無菌生理鹽水內將其制成濃度為108CFU·mL-1的菌懸液。取100μL菌懸液均勻涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，放入藥敏紙片，常規(guī)培養(yǎng)18 h后，測定抑菌圈直徑。參照藥敏紙片說明書根據其直徑大小進行敏感性分析。抑菌圈直徑小于給定最小值的表示為具有耐藥性（resistance，R），抑菌圈直徑大于給定最大值的表示為高度敏感（sensitivity，S），基于兩者之間的則表示為中度敏感（intermediate，I）。

2 結果與分析

2.1 患病藻體臨床癥狀

2.1.1 自然患病藻體臨床癥狀

如圖1所示，實驗采集的健康紫菜絲狀體附著基貝殼體表完好無損，絲狀體生長良好（圖1-a）；患病的紫菜絲狀體附著基貝殼體表具有大量黃色斑點（圖1-b）。取病灶處解剖可見黃色斑點成片擴散，附著基邊緣質脆易碎，病灶嚴重處出現(xiàn)泛白現(xiàn)象（圖1-c）。

圖1 健康與患病紫菜的絲狀體外觀對比Fig.1 Com parison of healthy and pathologicalmaps of P.yezoensis

2.1.2 回歸感染患病藻體臨床癥狀

用PZ201809121102菌懸液感染健康條斑紫菜絲狀體樣本。在13 d時，108CFU·mL-1感染試驗組貝殼表面迅速出現(xiàn)明顯青黃色斑點（圖2-a）；繼續(xù)感染后，貝殼表面出現(xiàn)黃色斑點擴散（圖2-b），擴散速度快，斑點顏色加深，附著基樣本殼表面出現(xiàn)被腐蝕現(xiàn)象（圖2-c）。實驗期間，對照組貝殼附著基表面沒有出現(xiàn)病變現(xiàn)象（圖2-d），濃度低于108CFU·mL-1的試驗組貝殼附著基表面無明顯黃色斑點。

刮取黃色病斑部位進行細菌再分離和鑒定菌株（編號為PZ201810121030）。通過16S rDNA比對分析結合生化檢測分析表明，感染前后優(yōu)勢菌株的生理生化和遺傳特性均未發(fā)生改變，表明菌株PZ201809121102是此次引起條斑紫菜絲狀體黃斑病的病原菌。

2.1.3 感染藻體顯微觀察

在無菌條件下取感染后患病明顯的條斑紫菜絲狀體附著基貝殼樣本，將貝殼表面多次清洗，并對健康藻體同步取樣。分別將患病與健康樣本制成的水浸片放置在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：對照組條斑紫菜絲狀體有大量孢子囊枝，孢子囊由單列橢圓形細胞組成，孢子囊具細胞壁，細胞生長發(fā)育成熟（圖3-a）?；疾l斑紫菜絲狀體的孢子囊細胞形態(tài)由橢圓形逐漸溶解，細胞壁融化、消失，胞內色素變淺，細胞結構被破壞，整個藻枝融化形成不定形的放散狀（圖3-b）。

2.2 病原分離與形態(tài)觀察

菌株PZ201809121102恒溫條件下培養(yǎng)24 h后，觀察到在2216E培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)最明顯。其表面光滑，呈細小圓形，亮黃色，中間突起，匍匐鑲嵌于平板培養(yǎng)基之上（圖4-a）。革蘭氏染色結果表明，該菌為革蘭氏陰性桿菌（圖4-b）。透射電鏡下觀察到該菌株有細胞膜（圖4-c，見箭頭處）、尾部有一根極細長的單端生鞭毛（圖4-c），兩端鈍圓，呈直、短桿狀，細胞大小為（0.5～1.0）μm×（1.5～5.0）μm。

圖2 人工回歸感染條斑紫菜絲狀體病變過程Fig.2 Lesion process of P.yezoensis by artificial regression infection

圖3 健康與患病紫菜絲狀體病變對比Fig.3 Comparison of healthy and pathological filaments of P.yezoensis

圖4 分離菌落PZ201809121102形態(tài)Fig.4 M orphological features of strain PZ201809121102

2.3 分子生物學鑒定結果

通過菌株的PCR擴增獲得菌株PZ201809121102的16S rDNA序列片段，經電泳檢測表明片段大小約1 400 bp。構建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示PZ201809121102與淺黃假單胞菌的同源性相似性最高，為100%：在所建系統(tǒng)發(fā)育樹中也與淺黃假單胞菌聚為一支（圖5）。

2.4 菌株生理生化鑒定

生 理生化檢測結果表明，菌株PZ201809121102可在無鹽胰胨水、6%NaCl胰胨水、10%NaCl胰胨水中生長。氧化酶反應呈陽性，3%NaCl ONPG反應呈陽性，鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶反應均呈陽性。能代謝利用單糖葡萄糖，不能利用鼠李糖、蜜二糖、蔗糖、乳糖、山梨醇等二糖或多糖。對菌株PZ201809121102進行分類鑒定，初步確定篩選菌株PZ201809121102生理生化特征與淺黃假單胞菌標準菌株LMG21995T相符。具體生理生化鑒定結果見表1。

圖5 菌株PZ201809121102的16S rDNA基因序列聚類分析Fig.5 Clustering analysis of bacterial strain PZ201809121102 based on gene sequence of 16S rDNA

表1 分離菌株PZ201809121102生理生化鑒定結果Tab.1 Physiological and biochem ical characteristics of the isolated strain PZ201809121102

2.5 菌株藥物敏感性實驗

菌株PZ201809121102藥物敏感實驗結果如表2所示。本研究所選用的36種抗生素中，該菌株對：羅美沙星、氟羅沙星、氯霉素、青霉素、慶大霉素、阿奇霉素、卡那霉素、氟哌酸、頭孢他啶等10種藥物呈現(xiàn)高度敏感；對利福平、紅霉素、吡哌酸、萘啶酸、四環(huán)素、頭孢唑啉、頭孢氨芐、頭孢拉定、恩諾沙星、氟苯尼考、阿奇霉素、新生霉素、多粘菌素、氨芐青霉素、苯唑青霉素、二甲胺四環(huán)16種藥物呈現(xiàn)耐藥性。

3 討論

近年來，隨著紫菜養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大和近海養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，紫菜育苗期病害發(fā)生日益頻繁。關于海養(yǎng)條斑紫菜育苗期絲狀體黃斑病病害發(fā)生的致病原研究，國內外還沒有統(tǒng)一的結論，有據可查的其病害研究報道最早始于20世紀70年代的癌腫病，國外學者對該病的外觀癥狀、光鏡觀察等結果作了初步描述，并同時也將其命名為“鯊皮病”［10］。國內學者王洪斌等［11］曾報道，河豚毒素交替假單胞菌（Pseudoalteromonas tetraodonis）是引發(fā)條斑紫菜育苗期絲狀黃斑病中爆發(fā)的一種病原菌。本實驗從條斑紫菜絲狀體育苗期苗種大規(guī)模出現(xiàn)黃斑病的病癥現(xiàn)象入手，著手展開了病原學分析。

實驗從患病藻體上分離得到一株致病菌PZ201809121102，該菌株鑒定為假單胞菌屬的淺黃假單胞菌，它又被稱為淺黃金色單胞菌。淺黃假單胞菌菌落呈淺黃色，專性需氧，無芽孢、莢膜，細胞呈桿狀略彎，有端鞭毛，能運動，革蘭氏陰性桿菌，屬于假單胞菌科假單胞菌屬，該菌株廣泛分布于土壤、潮濕環(huán)境中［12-14］。國外關于淺黃假單胞菌研究，報道過該菌可感染人體引發(fā)敗血癥、腹膜炎、腦膜炎等［15］。國內關于淺黃假單胞菌的報道有張海琳等［16］從患病大鯢（Andrias davidianus）病灶處分離鑒定淺黃假單胞菌可使健康魚體體表腫脹、出血、潰瘍和死亡；曹旭等［17］研究報道了淺黃假單胞菌在薄皮甜菜瓜（CucumismeloL.）的病后防治效果及抑菌能力方面是一株潛力生防菌；明德松等［18］分離的淺黃假單胞菌對頭孢菌素類、四環(huán)素類、酰胺醇類等抗菌藥物敏感。

本次實驗將淺黃假單胞菌株的菌懸液接種浸染健康條斑紫菜絲狀體，筆者發(fā)現(xiàn)它對紫菜絲狀體具有明顯的致病性。該菌懸液浸染藻體時，6個濃度組（103CFU·mL-1、104CFU·mL-1、105CFU·mL-1、106CFU·mL-1、107CFU·mL-1、108CFU·mL-1）進行感染實驗，其中以108CFU·mL-1試驗組貝殼表面發(fā)現(xiàn)絲狀體附著物貝殼表面病灶處出現(xiàn)大小不一的黃色斑點最明顯，隨著感染時間推移，黃色褐斑逐漸向四周擴散，最終出現(xiàn)由藻體死亡導致的潰爛癥狀；筆者再結合水浸片絲狀體鏡檢觀察，分析認為病原菌浸染藻體時，藻體細胞壁作為細胞結構的第一道保護屏障其結構受到損傷，損傷部位隨浸染時間的推移，聚集大量病原菌，病原菌在此吸取營養(yǎng)，迅速生長繁殖，導致藻體細胞色素被侵蝕，色素體解體，細胞間質松弛，細胞核逐漸消融，細胞形態(tài)由橢圓形逐漸溶解、消失，藻枝融化形成不定形的放散狀，藻枝整個細胞結構被破壞，最終導致絲狀體細胞消亡，發(fā)生黃斑病害。同時，本實驗分離得到的淺黃假單胞菌對羅美沙星、氟羅沙星、青霉素、慶大霉素、阿奇霉素、卡那霉素、氟哌酸、頭孢他啶種藥物呈現(xiàn)高度敏感，而氯霉素是國家禁用漁藥，只適合實驗研究使用。根據以上實驗結果分析討論，筆者建議條斑紫菜養(yǎng)殖育苗期間黃斑病病害的防控基礎重點可從控制養(yǎng)殖區(qū)病原菌濃度入手，控制淺黃假單胞菌病原的數(shù)量在108CFU·mL-1以下，此外，實驗前期流行病學調查過程中發(fā)現(xiàn)，暴發(fā)疾病的紫菜養(yǎng)殖海區(qū)溫度快速升高，海水鹽度變化時黃斑癥病害發(fā)生尤為嚴重，針對養(yǎng)殖區(qū)外在環(huán)境這一特點的變化，后續(xù)研究可以進一步應用感染微生態(tài)學原理，建立絲狀體黃斑病疾病發(fā)生的預警模型和相關防御措施，從而及時預防減輕病害帶來的危害。

表2 菌株PZ201809121102對抗菌藥物的敏感性Tab.2 Sensitivity of the strain PZ201809121102 to some antibacterial drugs

4 小結

本研究于山東省日照市嵐山區(qū)藻類養(yǎng)殖合作社某紫菜育苗場暴發(fā)黃斑病的育苗期條斑紫菜的病灶部位分離出一株優(yōu)勢菌PZ201809121102。通過分子生物學鑒定確定了其屬于淺黃假單胞菌，是引發(fā)條斑紫菜絲狀體黃斑病的一種致病菌。研究結果為條斑紫菜絲狀體黃斑病的病原菌種類鑒定及其防治提供了有益參考，為今后深入研究條斑紫菜絲狀體黃斑病病害發(fā)生的致病因素與淺黃假單胞菌的關系打下基礎。