李大命，唐晟凱，劉燕山，谷先坤，殷稼雯，蔣琦辰，朱 凜，李春寧，張彤晴，潘建林

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點實驗室，南京 210017）

魚類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）呈共價閉合環(huán)裝，是細胞核外具自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的遺傳因子。與核DNA相比，魚類mtDNA具有分子小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、遺傳相對獨立和母系遺傳等特點，是一個相對獨立的復(fù)制單位［1-2］，也是魚類分子群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究中常用的分子標(biāo)記?？刂茀^(qū)（displacement loop region，D-loop）是mtDNA上的一段非編碼區(qū)，其在整個mtDNA中是堿基突變和長度變異最大、進化速度最快的序列，較適合用于魚類種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析［3-4］。采用線粒體D-loop序列作為分子標(biāo)記，用于分析多種魚類的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，可為漁業(yè)資源保護及合理利用提供重要依據(jù)［5-7］。

目前大部分魚類群體遺傳學(xué)研究對象主要集中在經(jīng)濟魚類或者瀕危魚類，而對經(jīng)濟價值相對偏低的小型魚類的研究常被忽視［8］。湖鱭（Coilianasustaihuensis）隸屬于鯡形目，鳀科，鱭屬，是我國常見的一種小型魚類，一般認(rèn)為其是洄游性刀鱭的湖泊定居生態(tài)型，主要分布在通江的江河及其附屬湖泊，終生生活在江河及湖中，不進行生殖洄游，在生態(tài)習(xí)性和形態(tài)上與洄游型刀鱭有一定差別［9-10］。湖鱭游泳迅速，拓殖能力強，具有性成熟早、繁殖率高、食性廣等優(yōu)勢，近十年來湖鱭種群數(shù)量大幅增加，已成為湖泊魚類群落的絕對優(yōu)勢種群，在維持湖泊生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定中占據(jù)重要地位，能對湖泊的整個漁業(yè)資源及水質(zhì)環(huán)境起到指示作用［11-15］。湖鱭作為湖泊漁業(yè)資源的重要捕撈對象，同時面臨著資源過度開發(fā)利用、種群結(jié)構(gòu)低齡化等亟待解決的問題［16-17］。而迄今有關(guān)湖鱭的研究主要集中在生長、年齡、食性等基礎(chǔ)生物學(xué)方面［16，18-21］，遺傳學(xué)資料相對較少。

江蘇省位于長江、淮河下游，湖泊眾多，漁業(yè)資源豐富，是我國湖鱭資源的重要分布區(qū)。湖鱭是江淮下游附屬湖泊太湖、洪澤湖魚類群落中的優(yōu)勢種，也是漁業(yè)生產(chǎn)中重要的利用對象［12-13，15］。迄今，對太湖、洪澤湖湖鱭遺傳多樣性已有報道［10，22-25］，但尚缺乏對江淮下游流域湖泊湖鱭遺傳結(jié)構(gòu)及其分布格局的系統(tǒng)研究。本研究以線粒體D-loop全序列為分子標(biāo)記，對長江流域的太湖、滆湖和淮河流域的高郵湖、白馬湖、洪澤湖和駱馬湖共6個湖鱭群體的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及進化歷史進行分析，以期為湖鱭種質(zhì)資源科學(xué)管理和合理利用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

用刺網(wǎng)采集太湖（TH）、滆湖（GH）、高郵湖（GYH）、白馬湖（BMH）、洪澤湖（HZH）和駱馬湖（LMH）共6個湖泊的湖鱭樣本，采樣時間為2016年10月至2018年10月。將樣本用無水乙醇固定，帶回實驗室放入冰箱中保存?zhèn)溆谩２蓸游恢眉皹颖净镜男畔⒁妶D1和表1。

1.2 基因組DNA的提取

取樣品的肌肉組織用于基因組DNA的提取。購買寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的廣譜型基因組DNA小量試劑盒提取總DNA，將DNA溶于去離子水中。用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA的完整性和濃度，置DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 湖鱭樣本采樣點位置Fig.1 Sam p ling location of Coilia nasus taihuensis sam p les

表1 基于線粒體D-loop序列的湖鱭群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.1 Genetic diversity parameters of C.nasus taihuensis based on m tDNA D-loop sequences

1.3 PCR擴增與測序

湖鱭線粒體D-loop區(qū)序列的上游引物為DF1（5′-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3′），下游 引 物 為DR2（5′-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′）［26］，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR擴增反應(yīng)總體積為50μL：10×PCR Buffer 5μL，5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.4μL，0.25 mmol·L-1dNTP 4μL，10μmol·L-1上下游引物各2μL，DNA模板1.5μL，加超純水至總體積50μL。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性4 min；94℃40 s，55℃50 s，72℃60 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測和純化后，送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行正反雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

采用BioEdit7.0軟件讀取D-loop序列，并對序列進行編輯和拼接，利用ClustalX 1.83軟件對D-loop序列進行比對和排序；采用Mega 7.0軟件統(tǒng)計序列堿基組成和變異位點，并基于Kimura雙參數(shù)模型計算群體間的遺傳距離，采用鄰接法（neighbour-joiningmethod，NJ）構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進化樹，經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣檢測其置信度；采用DnaSP 5.1軟件確定序列的單倍型、單倍型多樣性、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)等參數(shù)；應(yīng)用Arleqin 3.5軟件進行分子方差分析（AMOVA），評估群體間的遺傳變異情況，利用遺傳分化指數(shù)Fst來評價兩兩群體間的遺傳差異，通過1 000次重抽樣來檢查兩兩群體間的Fst顯著性。進行Tajima'sD和Fu'sFs中性檢驗和錯配分析，推測種群的歷史動態(tài)。利用Network 5.0軟件構(gòu)建單倍型最小網(wǎng)絡(luò)圖，分析單倍型間的進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖鱭D-loop序列變異和群體遺傳多樣性

本研究共獲得214條湖鱭的線粒體D-loop全序列，長度為1 214 bp至1 328 bp。214條序列共發(fā)現(xiàn)103個變異位點，其中簡約信息位點56個，單一信息位點47個，存在5處插入／缺失序列。轉(zhuǎn)換位點13個，顛換位點4個，轉(zhuǎn)換／顛換比為3.5。6個群體的控制區(qū)序列的堿基組成相似，A、C、T和G的平均含量分別為33.3%、19.1%、33.4%和14.3%，堿基A＋T的含量（66.6%）遠大于G＋C的含量（33.4%），體現(xiàn)出明顯的AT堿基偏好性和典型的反G偏倚，吻合大多數(shù)脊椎動物線粒體DNA堿基組成特征［27］。

6個湖鱭群體214尾樣本共檢出92種單倍型（H1～H92），其中太湖群體有20種單倍型，滆湖群體有21種單倍型，高郵湖群體有18種單倍型，白馬湖群體有24種單倍型，洪澤湖群體有17種單倍型，駱馬湖有16種單倍型（表1）。H1是6個群體的共享單倍型，H5是洪澤湖和高郵湖群體的共享單倍型，H35和H42是白馬湖和駱馬湖群體的共享單倍型，H37和H51是高郵湖和洪澤湖群體的共享單倍型，H39是白馬湖、洪澤湖和駱馬湖群體的共享單倍型，H45是高郵湖、白馬湖、洪澤湖和駱馬湖群體的共享單倍型，H48是高郵湖、白馬湖和洪澤湖群體的共享單倍型，H54和H87是高郵湖和滆湖群體的共享單倍型，H62是白馬湖和洪澤湖群體的共享單倍型，H63是洪澤湖和駱馬湖群體的共享單倍型，H88是高郵湖、洪澤湖和駱馬湖群體的共享單倍型，H91是高郵湖和白馬湖群體的共享單倍型，其他單倍型都是群體的獨有單倍型。

6個群體的單倍型多樣性為0.726～0.951，核苷酸多樣性為0.005 52～0.010 36，6個群體整體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.857和0.007 29（表1）?？梢钥闯?，湖鱭群體具有豐富的遺傳多樣性，且湖鱭多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性特點。

2.2 湖鱭群體遺傳結(jié)構(gòu)

6個群體間的遺傳距離在0.005 45至0.011 74之間變化，其中太湖與滆湖群體間的遺傳距離最大，高郵湖與洪澤湖群體間的遺傳距離最?。ū?）。6個群體間的遺傳分化系數(shù)Fst值在-0.022 05至0.192 21之間，其中長江流域的太湖和滆湖群體間的Fst值最大，而淮河流域的4個群體間Fst值較?。?0.022 05～0.043 91）。統(tǒng)計檢驗結(jié)果顯示，滆湖群體與其他5個群體間有極顯著的遺傳分化（P＜0.001），其他5個群體間沒有顯著的遺傳差異（P＞0.05）（表2）。

分子方差分析（AMOVA）結(jié)果顯示，群體間分子變異占比為6.20%，群體內(nèi)分子變異占比為93.80%，說明分子變異主要發(fā)生在群體內(nèi)。群體總的遺傳分化系數(shù)Fst值為0.061 99，且統(tǒng)計檢驗具有極顯著性差異，說明群體間出現(xiàn)了顯著遺傳差異（表3）。將6個群體按水系劃分為長江流域組（太湖和滆湖群體）和淮河流域組（高郵湖、白馬湖、洪澤湖和駱馬湖群體），對2組群進行分子方差分析，結(jié)果顯示，組間分子變異占比為1.76%，組內(nèi)群體間分子變異占比為5.28%，群體內(nèi)分子變異占比為92.96%。組間的遺傳分化系數(shù)值Fct為0.017 56，統(tǒng)計檢驗結(jié)果無顯著性差異；組內(nèi)群體間的遺傳分化系數(shù)值Fsc值為0.057 36，群體內(nèi)的Fst值為0.070 38，且統(tǒng)計檢驗均具有極顯著性差異，表明組內(nèi)群體間及群體內(nèi)出現(xiàn)顯著遺傳分化（表3）。

表2 湖鱭群體間遺傳距離（對角線下）及遺傳分化系數(shù)（對角線上）Tab.2 Genetic distiances（below diagonal）and F st（above diagonal）among C.nasus taihuensis populations

表3 湖鱭群體的分子方差分析結(jié)果Tab.3 Results of analysis ofmolecular variance（AMOVA）of C.nasus taihuensis populations

2.3 湖鱭單倍型系統(tǒng)樹和網(wǎng)絡(luò)進化圖

以鄰接法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示，6個湖鱭群體可以劃分為2個較大的譜系，其中譜系1由單倍型H1至H74組成，譜系支持率小于50%；譜系2由單倍型H75至H92組成，譜系支持率為76%?？梢钥闯?，同一群體的單倍型沒有聚集為單系，而是分散在兩個譜系中，說明還沒有出現(xiàn)群體的譜系分化。

以中接法構(gòu)建了湖鱭各單倍型進化網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），整個網(wǎng)絡(luò)圖呈非典型的星狀結(jié)構(gòu)，單倍型H1是6個群體的共享單倍型，也是數(shù)量最多的單倍型，位于網(wǎng)絡(luò)進化圖的中心，推測可能為群體的祖先單倍型。該單倍型關(guān)系圖支持系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，單倍型形成了2個進化分支，各單倍型相互散布在2分支中，未形成明顯的系統(tǒng)地理格局。

2.4 湖鱭群體的歷史動態(tài)

對6個湖鱭群體進行Tajima'sD和Fu'sFs中性檢驗，并估算群體的擴張時間（表4）。結(jié)果顯示，滆湖群體的Tajima'sD和Fu'sFs檢驗均為負(fù)值，但并未達到顯著水平（P＞0.05）；其他群體的Tajima'sD和Fu'sFs檢驗均為負(fù)值，但Tajima'sD檢驗未達到顯著水平（P＞0.05），F(xiàn)u'sFs檢驗達到顯著水平（P＜0.05）；將6個群體作為一個整體進行分析，結(jié)果表明Tajima'sD和Fu'sFs檢驗均為負(fù)值，并達到顯著水平（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，太湖、高郵湖、白馬湖、洪澤湖和駱馬湖群體及湖鱭整體經(jīng)歷了種群擴張。根據(jù)群體的擴張參數(shù)Tau，以線粒體控制區(qū)的變異速率每百萬年變異15%～20%推算［28］，可估算出湖鱭群體擴張時間T發(fā)生在0.089～0.160百萬年前的更新世晚期。

3 討論

3.1 湖鱭群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，是物種適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境、維持生存與進化的重要基礎(chǔ)。研究物種的遺傳多樣性水平、形成機制及分布格局，可以揭示物種的進化歷程，準(zhǔn)確評價種群的生存、擴張及環(huán)境適應(yīng)能力。在眾多的分子標(biāo)記中，線粒體DNA具有諸多優(yōu)勢，是種群遺傳研究的首選分子標(biāo)記［29］，而單倍型多樣性（h）和核酸多樣性（π）是衡量某一物種遺傳多樣性的2個常用指標(biāo)［30］。

本研究應(yīng)用mtDNA D-loop區(qū)序列對江蘇省6個湖泊湖鱭群體遺傳多樣性進行分析，結(jié)果表明，6個湖鱭群體的單倍型多樣性為0.726～0.951，核苷酸多樣性為0.005 52～0.010 36，6個群體總的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.857和0.007 29，且核苷酸多樣性與平均核苷酸差異數(shù)變化趨勢一致。有文獻［24］報道4個湖泊（太湖、巢湖、鄱陽湖和洞庭湖）湖鱭群體的單倍型多樣性為0.993～1.000，核苷酸多樣性為0.006 2～0.011 5，本研究結(jié)果與其相一致，說明湖鱭群體的遺傳多樣性比較豐富，對環(huán)境的適應(yīng)能力及進化潛力較大。另外，湖鱭游泳迅速，拓殖能力強，且具有性成熟早、繁殖率高、食性廣等優(yōu)勢，以致其野生資源量急劇增加，形成了數(shù)量龐大的群體，成為湖泊魚類群落中的優(yōu)勢種群，并對漁業(yè)資源及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了重要影響［11-15］。依據(jù)GRANT和BOWEN［28］提出的海洋魚類4種遺傳多樣性模式來劃分，湖鱭群體屬于第二種類型（高h低π），說明湖鱭群體易受環(huán)境變化的影響，經(jīng)歷過快速的擴張期，種群數(shù)量大幅增多，堿基的突變導(dǎo)致單倍型種類數(shù)量和單倍型多樣性的增加，而核苷酸多樣性沒有獲得足夠的時間積累，這與文獻報道的其他地理群體的研究結(jié) 果一致［23-25，31］。Tajima'sD［32］和Fu'sFs［33］中性檢驗結(jié)果也證明了湖鱭經(jīng)歷了種群擴張，擴張大約發(fā)生在0.089～0.160百萬年前。湖鱭是一種小型魚類，生命周期短，性成熟早，屬于典型的r-策略生物［12，18-19］，這種生活史特征對群體數(shù)量快速增加、高單倍型多樣性的形成具有明顯的促進作用。

圖2 基于D-loop序列構(gòu)建的湖鱭單倍型系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree of C.nasus taihuensis haplotypes based on D-loop sequences

3.2 湖鱭群體遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳分化系數(shù)Fst是衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)，F(xiàn)st值越大則表示遺傳分化程度越大。FREELAND［34］提出，以Fst值分別是0.05、0.15和0.25為臨界值指示遺傳分化程度。本研究中，群體間的Fst值統(tǒng)計結(jié)果表明，滆湖群體與其他群體間的Fst值均大于0.15，且統(tǒng)計檢驗具有極顯著性差異。除滆湖群體外，其他5個群體間Fst值為-0.022 05至0.044 66，且統(tǒng)計檢驗沒有顯著性差異?？梢缘贸?，滆湖群體與其他群體間具有顯著遺傳分化，而其他群體間無遺傳分化。湖鱭群體總的Fst值為0.061 99，且具有極顯著性差異，也說明部分群體間出現(xiàn)顯著遺傳差異。從單倍型系統(tǒng)進化樹和網(wǎng)絡(luò)進化圖來看，較多的滆湖群體獨享單倍型形成了置信度較高的進化譜系，支持了湖鱭群體的遺傳結(jié)構(gòu)。

一般來說，魚類的遺傳分化格局與其分布的水系格局及地理距離密切相關(guān)［35-36］，并受到多種因素的影響，比如魚類生活史、環(huán)境因素及進化歷史等［24，31，37-38］。本研究結(jié)果顯示，淮河水系的4個湖鱭群體沒有出現(xiàn)顯著性遺傳差異，而長江水系的滆湖和太湖群體出現(xiàn)極顯著的遺傳分化；太湖群體與淮河水系的4個群體沒有形成顯著性遺傳分化，而滆湖群體與淮河水系的4個群體形成顯著的遺傳差異。MA等［31］基于線粒體D-loop區(qū)序列對我國4個水系的10個湖鱭群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)10個群體之間存在遺傳差異，基因交流受到限制，水文地理隔離是導(dǎo)致種群遺傳分化的主要因素。湖鱭喜集群，且游泳迅速，具有較強的種群擴散能力，有利于群體間的基因交流［12］。另外，水系連通是魚類擴散和基因交流的重要途徑［39］。歷史上，太湖與淮河水系的高郵湖、洪澤湖和駱馬湖等湖泊通過京杭大運河流通；近年來，通過京杭大運河實施南水北

圖3 湖鱭單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Parsim ony network of C.nasus taihuensis hap lotypes

表4 基于D-loop序列的湖鱭群體中性檢驗及擴張時間估算Tab.4 Statistical tests for neutrality and time of expansion of C.nasus taihuensis based on D-loop sequences

調(diào)及引江濟太等水利措施，均有利于湖泊間湖鱭種群擴散，消除群體間遺傳差異［39］。滆湖雖與太湖同屬長江水系，距離較近，但可能受堤壩涵閘的阻礙及生態(tài)環(huán)境差異而形成地理隔離。另外，從群體歷史動態(tài)來看，除滆湖外的其他5個群體受環(huán)境影響較大，經(jīng)歷了顯著的種群擴張過程，擴張時間約為0.160至0.089百萬年前，這一時期處于更新世晚期，全球氣候變化劇烈，歷經(jīng)第四紀(jì)冰期和間冰期氣候的交替變化，對魚類生物多樣性及分布格局具有重要影響［8，35-37］。滆湖群體受環(huán)境影響較小，種群較為穩(wěn)定，沒有經(jīng)歷顯著的種群擴張，滆湖群體的部分個體躲過了不利環(huán)境的干擾，經(jīng)歷了長時間相對的穩(wěn)定進化，與其他群體形成了遺傳分化。

3.3 湖鱭資源的管理和利用

作為一種小型魚類，湖鱭已成為江蘇省淡水湖泊魚類群落中的優(yōu)勢種群，是漁業(yè)生產(chǎn)的重要捕撈對象，同時也面臨資源過度開發(fā)利用、種群組成趨于低齡化等問題。本研究結(jié)果顯示，江蘇省6個湖鱭群體的遺傳多樣性較為豐富，具有高單倍型多態(tài)性和低核苷酸多態(tài)性的特點。6個群體中，滆湖群體的遺傳多樣性水平最高，擁有的獨享單倍型最多，且與其他5個群體間有極顯著的遺傳分化，因此，應(yīng)將滆湖群體單獨作為一個進化顯著單元進行管理，可建立滆湖湖鱭水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)，保護特有的湖鱭遺傳資源；其他5個群體作為一個整體進行管理和利用，對其中高郵湖和洪澤湖等遺傳多樣性較低的群體，應(yīng)進行重點保護。一方面，需要嚴(yán)格控制湖泊漁業(yè)資源的捕撈強度，禁止對湖鱭資源過度開發(fā)利用，可通過延長禁漁期、增大漁具網(wǎng)目尺寸及提高開捕年齡來優(yōu)化湖鱭種群年齡組成。另一方面，可通過適量增殖放流肉食性的翹嘴鲌（Culter alburnus）、鱖（Sinipercachuatsi）等魚類，調(diào)控湖鱭種群數(shù)量，改善湖泊魚類群落結(jié)構(gòu)，避免魚類群落結(jié)構(gòu)小型化，促進湖泊漁業(yè)資源可持續(xù)健康發(fā)展。