劉太陽，劉卓卓，朱 玉，李 博

(1．重慶市涪陵中心醫(yī)院燒傷整形科，重慶 408000；2.重慶市涪陵區(qū)婦幼保健院婦科，重慶 408000)

放射治療簡稱放療，是臨床上治療惡性腫瘤的常用手段，放射線在殺死腫瘤細胞的過程中也會損傷患者周圍正常組織、器官，其中放射性皮膚損傷是放射治療的主要并發(fā)癥[1]。目前主要通過外敷乳膏、噴劑等治療放射性皮膚損傷，例如細胞因子類、三乙醇胺乳膏以及糖皮質(zhì)激素軟膏等藥物，也有少數(shù)通過靜脈注射放射防護藥物，但治療效果均不顯著[2-3]。蘆薈凝膠多糖是蘆薈中重要的生物活性物質(zhì)，研究顯示，其生理活性較強，在免疫調(diào)節(jié)方面具有廣譜性，同時在抗輻射、抗腫瘤方面效果顯著，還具有抗?jié)儭⒚廊葑o膚等功效[4-5]。目前蘆薈凝膠多糖對急性放射性皮膚損傷的研究較少。本研究通過探討蘆薈凝膠多糖對急性放射性皮膚損傷模型的修復(fù)作用及相關(guān)機制，以期為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

選取40只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量為160～220 g，均由華阜康生物科技股份有限公司提供[動物生產(chǎn)許可證號為SCXK：(京)2019-0017]。所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食，室溫18～25 ℃。庫拉索蘆薈購自海南南洋蘆薈生物工程有限公司，酶聯(lián)免疫試劑盒及其分析純購自美國GIBCO公司，蘇木精—伊紅試劑購自上?；鄯f生物科技有限公司，VEGF抗體及PI3K、Akt、mTOR一抗和二抗購自武漢艾德思科技文化有限公司，BCA試劑盒及其試劑購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性放射性皮膚損傷模型建立 40只大鼠中選取10只為正常組，其余30只參考文獻[6]建立急性放射性皮膚損傷模型：將大鼠固定后，采用脫毛試劑(飽和硫化鈉+等量滑石粉)在大鼠左后肢均勻涂抹，20 min后用紗布去除試劑并進行脫毛處理；0.1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，大鼠在擺位床中呈環(huán)形，保證左后肢在射線照射范圍內(nèi)；使用鉛板對非照射部位進行遮擋。采用6 MeV電子線照射大鼠左后肢脫毛部位的皮膚，劑量率為400 cGy/min，一次性照射劑量為40 Gy。正常組僅做脫毛處理。

1.2.2 蘆薈凝膠多糖制備及分組 摘取新鮮蘆薈葉，清洗干凈后，經(jīng)過剪刺、去皮，將凝膠打漿，取100 g采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法[7]浸提，真空抽濾，減壓濃縮至20 mL，加4倍體積無水乙醇沉淀，于4 ℃靜置過夜。經(jīng)過沉淀、過濾后，分別添加無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，最后冷凍、干燥，得到白色粉末。采用硫酸—蒽酮法測定多糖含量，其范圍在5～40 μg/mL。30只模型大鼠隨機分為低劑量組、高劑量組、模型組各10只。低劑量組、高劑量組分別以單層紗布浸潤0.4 mg/mL、0.8 mg/mL的蘆薈凝膠多糖外敷干預(yù)；模型組和正常組的單層紗布浸潤的等體積生理鹽水外敷，各組大鼠均連續(xù)干預(yù)1個月。

1.2.3 創(chuàng)面愈合時間、放射性皮膚損傷評級 記錄各組大鼠創(chuàng)面愈合時間。參考急性放射性皮膚損傷評級標準[8]對模型大鼠皮膚損傷狀況進行評估：0級，大鼠皮膚無任何變化；Ⅰ級，大鼠皮膚表現(xiàn)為點狀紅斑，脫毛，呈干性脫皮；Ⅱ級，大鼠皮膚紅斑明顯，伴有斑狀濕性脫皮，中度水腫；Ⅲ級，大鼠產(chǎn)生融合性濕性脫皮，凹陷水腫；Ⅳ級，大鼠皮膚出現(xiàn)潰瘍、出血、壞死等。

1.2.4 創(chuàng)面微血管密度、VEGF含量檢測 抽取大鼠腹部靜脈血3 mL,以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清。采用酶聯(lián)免疫法檢測VEGF含量：將提前稀釋好的標準品100 μL加入相應(yīng)的微孔板反應(yīng)孔中，第1孔只加樣品稀釋液為零孔。蓋上模板混合均勻，在37 ℃下反應(yīng)90 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；將準備好的0.1 mL VEGF抗體加入到每孔中，在37 ℃下反應(yīng)60 min，空白孔不加底物四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMS)；甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿0.01 mol/L PBS，浸泡1～2 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；每孔加入90 μL TMS，避光處理15～20 min；每孔加入90 μL TMS終止液，即藍色變?yōu)辄S色。在波長450 mm處分析VEGF水平。制作常規(guī)石蠟切片，選擇10個連續(xù)不重疊的切片于高倍鏡下觀察微血管數(shù)量。

1.2.5 病理學觀察 處死大鼠，解剖后快速提取左后肢皮膚組織制作標本，4%多聚甲醛固定，制作常規(guī)石蠟切片；0.5%蘇木精—伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.6 PI3K-Akt-mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達檢測 采用Western blot檢測，將采集到的血液標本以3 000 r/min離心處理10 min，取上清液，采用BCA法進行蛋白定量測定，在2×SDS凝膠緩沖液中加入蛋白50 μg，于100 ℃下加熱5 min進行蛋白變性。凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，取膜，于4 ℃在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理1 h，使用0.05%～0.1% TBST稀釋一抗(PI3K、Akt、mTOR，1∶1 000)，于4 ℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜3次，每次5 min。0.05%～0.1% TBST稀釋二抗(1∶10 000)，搖動孵育1 h，再次用TBST連續(xù)洗膜3次，每次5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合時間比較

低劑量組和高劑量組創(chuàng)面愈合時間均短于模型組，且高劑量組短于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

*：與模型組比較，P<0.05；#：與低劑量組比較，P<0.05

2.2 放射性皮膚損傷評級比較

與模型組相比，正常組大鼠0級較多，Ⅳ級較少；與模型組比較，低劑量組和高劑量組大鼠Ⅳ級較少，差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 放射性皮膚損傷評級比較(n=10，只)

2.3 創(chuàng)面微血管密度、VEGF含量比較

模型組、低劑量組和高劑量組創(chuàng)面微血管密度、VEGF含量均低于正常組(P<0.01)；低劑量組和高劑量組創(chuàng)面微血管密度、VEGF含量高于模型組(P<0.01)；高劑量組創(chuàng)面微血管密度、VEGF含量高于低劑量組，差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.4 病理學觀察

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組表皮細胞較為平整，棘細胞、成纖維細胞排列整齊，未發(fā)現(xiàn)狹窄、增寬等，皮脂腺、毛囊、汗腺等正常，肌纖維結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細胞浸潤；模型組細胞表皮呈波浪狀，不整齊，無棘細胞排列，膠原纖維、毛囊、汗腺被破壞，真皮層內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤，新生血管較為少見；低劑量組和高劑量組潰瘍表面有新生皮膚、肉芽形成，新生血管明顯增加，炎癥細胞浸潤程度降低，其中高劑量組皮脂腺、毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)正常，膠原纖維、纖維母細胞數(shù)量增加，排列整齊(圖3)。

a:創(chuàng)面微血管密度;b:VEGF含量 *：與正常組比較，P<0.01；#：與模型組比較，P<0.01；△：與低劑量組比較，P<0.01

2.5 PI3K-Akt-mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達

模型組、低劑量組和高劑量組PI3K、Akt蛋白表達量均低于正常組，mTOR蛋白表達量高于正常組(P<0.05)；低劑量組和高劑量組PI3K、Akt蛋白表達量高于模型組，mTOR蛋白表達量低于模型組(P<0.05)；高劑量組PI3K、Akt蛋白表達量高于低劑量組，mTOR蛋白表達量低于低劑量組(P<0.05)，見圖4。

3 討論

臨床上將放射性皮膚損傷分為慢性放射性皮膚損傷、急性放射性皮膚損傷以及放射性皮膚癌[9]。放射性皮膚損傷患者臨床表現(xiàn)主要為局部皮膚瘙癢，嚴重者會發(fā)生脫皮、疼痛、潰瘍等，造成局部感染；病情嚴重的患者皮膚會變薄，產(chǎn)生瘢痕、攣縮[10-11]。研究證實，放射性皮膚損傷會降低患者生存質(zhì)量，進而大大降低患者對放射治療的依從性[9]，導(dǎo)致患者中斷放療，甚至是放棄治療，致使腫瘤得不到控制，生存率降低[12]。Yee等[13]的研究指出，在不降低放射治療效果的情況下，盡量減少放射治療對患者周圍正常皮膚組織產(chǎn)生的傷害，能明顯減輕患者痛苦，提高患者生活質(zhì)量，增加放射治療的依從性。

*：與正常組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與低劑量組比較，P<0.05

臨床研究顯示，蘆薈具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、抗真菌感染、抗輻射、促進傷口愈合等多種功效，在治療燒傷、創(chuàng)傷方面效果顯著[14]。蘆薈的化學成分相對復(fù)雜，有160多種成分，主要是以糖類、醌類化合物為主，還包括大量的有機酸、氨基酸等，維生素、酶類物質(zhì)也相對豐富，其中蘆薈多糖是蘆薈凝膠中最主要的活性物質(zhì)[15-16]。目前，蘆薈多糖在燙傷、燒傷方面的研究較多，但是其在放射性皮膚損傷中的應(yīng)用相對較少。目前，放射性皮膚損傷發(fā)病機制尚未明確，有學者認為放射線會導(dǎo)致機體中p53和Bax蛋白表達升高，使局部組織中的血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞以及表皮細胞發(fā)生壞死和凋亡，新生血管減少，創(chuàng)面收縮，進而導(dǎo)致表皮化發(fā)生[17]。也有研究指出，放射線會破壞活性氧、自由基結(jié)構(gòu)及機體上皮細胞基底層，導(dǎo)致放射性皮膚損傷發(fā)生[18]。

本研究中，大鼠創(chuàng)面經(jīng)過不同濃度的蘆薈凝膠多糖干預(yù)后，創(chuàng)面愈合時間有不同程度的縮短，其中高劑量組創(chuàng)面愈合時間最短，說明蘆薈凝膠多糖能促進放射性皮膚損傷創(chuàng)面愈合，且更高劑量的蘆薈凝膠多糖對促進愈合的效果更好。放射性皮膚損傷大鼠皮膚損傷評級越高，皮膚損傷越嚴重[19]。本研究中，模型組大鼠皮膚損傷評級Ⅳ級的數(shù)量較多，主要表現(xiàn)為表皮厚度增加，脫皮、水腫、潰瘍嚴重。低劑量組和高劑量組大鼠皮膚損傷為Ⅳ級的數(shù)量較模型組少，說明低劑量和高劑量蘆薈凝膠多糖均能改善放射性皮膚損傷大鼠皮膚損傷狀況。

創(chuàng)面微血管發(fā)生栓塞會導(dǎo)致組織缺血缺氧，這也是創(chuàng)面壞死的主要原因，創(chuàng)面微血管數(shù)量與組織中血流、氧供的修復(fù)有關(guān)，若創(chuàng)面有豐富的新生血管形成，創(chuàng)面組織能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)以及氧，則可加快創(chuàng)面愈合速度[20-21]。VEGF是內(nèi)皮細胞中重要的趨化因子，主要通過角質(zhì)、巨噬細胞分泌合成，VEGF會增加內(nèi)皮細胞纖溶酶原激活劑、膠原酶含量，促進毛細血管融合，形成大血管，在血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖過程中發(fā)揮著重要作用，可促進新生血管形成[22-23]。本研究結(jié)果顯示，大鼠創(chuàng)面經(jīng)不同濃度蘆薈凝膠多糖干預(yù)后，創(chuàng)面微血管密度、VEGF含量均有不同程度的提高，其中高劑量組效果最為顯著，說明蘆薈凝膠多糖能促進VEGF合成和釋放，促進放射性皮膚損傷模型創(chuàng)面新生血管形成，進一步加快大鼠創(chuàng)面愈合，且具有劑量依賴性。

PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，主要存在于細胞中，其活性主要體現(xiàn)在絲氨酸/蘇氨酸激酶方面，通過激活下游信號分子，在多種細胞活動中發(fā)揮著重要的作用[24]。Akt在磷酸化作用下，會激活mTOR，參與生物學活動[25]。PI3K/Akt信號通路在細胞凋亡過程中具有重要作用[26]。在創(chuàng)面早期，自噬是細胞保護機制之一，mTOR參與信號轉(zhuǎn)錄以及蛋白合成過程，并且mTOR在自噬信號轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，可誘導(dǎo)細胞自噬[27-28]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度蘆薈凝膠多糖干預(yù)后，大鼠PI3K、Akt蛋白表達量升高，mTOR蛋白表達量降低，說明蘆薈凝膠多糖可能通過調(diào)控PI3K-Akt-mTOR信號通路相關(guān)蛋白，促進大鼠創(chuàng)面愈合。在創(chuàng)面早期，由于炎癥反應(yīng)導(dǎo)致創(chuàng)面缺血、缺氧，營養(yǎng)不足，mTOR通路將細胞中的壞死物質(zhì)清除，有助于保持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，抵抗病原體入侵，減輕炎癥反應(yīng)，加快創(chuàng)面愈合速度[29-30]。

綜上所述，高劑量蘆薈凝膠多糖能促進急性放射性皮膚損傷大鼠模型創(chuàng)面新生血管形成，加快創(chuàng)面修復(fù)，其作用機制可能與PI3K-Akt-mTOR信號通路有關(guān)。