伍 燕， 吳德芳， 韋家美

(興義民族師范學院 生物與化學學院， 貴州 興義 562400)

0 引言

【研究意義】假芝(Amaurodermarugosum)屬靈芝科假芝屬，廣泛分布于我國熱帶和亞熱帶地區(qū)，其子實體傷變后呈紅色，故又叫血芝[1-2]。據(jù)《中國真菌志》第1版報道，假芝屬在國內(nèi)約有20種，主要分布在海南、廣西、廣東、福建、云南和貴州等地。假芝含有多種活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等功效。我國野生假芝資源豐富，貴州西南部的冊亨縣、望謨縣等地區(qū)每年6—10月均有大量假芝生長，但目前對當?shù)丶僦サ乃幱霉π狈α私?，更未開發(fā)相關(guān)的保健產(chǎn)品。因此，研究當?shù)丶僦サ乃幱霉πζ溟_發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在假芝屬中研究比較深入的有皺蓋假芝(Amaurodermarude)、漆黑假芝(Amaurodermaexile)和假芝(Amaurodermarugosum)，其研究內(nèi)容主要有資源分布、菌絲體發(fā)酵液的藥理活性、子實體的醇提物、氯仿餾分和水提物活性等[3-8]?，F(xiàn)代藥理活性研究表明，假芝所含活性成分有真菌多糖、甾醇類、生物堿、揮發(fā)油、脂肪酸和酚類等，這些活性成分具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂和保肝護肝等功效[9-14]?！狙芯壳腥朦c】目前，受傳統(tǒng)中醫(yī)用藥的影響，國內(nèi)醫(yī)藥保健市場上靈芝相關(guān)產(chǎn)品常見的是赤芝和紫芝，對株型較小的假芝了解僅限于理論水平，市場上未見用假芝開發(fā)的產(chǎn)品，因此，對野生假芝子實體的推廣和利用有著巨大的發(fā)展空間?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對采自貴州的野生假芝進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)對假芝菌絲體進行分離純化，對其一級菌絲體的可栽培特性進行研究；采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測野生假芝子實體醇提物的主要成分，并用不同極性溶劑石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次對假芝的乙醇浸膏進行萃取，采用MTT法檢測不同極性溶劑提取物對人類腫瘤細胞HCT-116和HepG2增殖的抑制作用，以期為深入了解貴州野生假芝的可培養(yǎng)特性、醇提物主要成分和抗腫瘤活性，以及開發(fā)利用貴州野生假芝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生假芝：采集自貴州省冊亨縣野生板栗樹下，采集地海拔約879 m。

腫瘤細胞：人肝癌細胞HepG2、結(jié)腸癌細胞HCT-116，均由廣西民族大學惠贈。

試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、5-氟尿嘧啶、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等，國藥集團。

儀器設(shè)備:UPLC-QTOF-MS/MS，美國Waters公司；Thermo Scientific Multi-skan FC酶標儀，美國賽默飛公司；ECLIPSE TS100倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司；YXQ-SL-100G高壓蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；DHJ-9246A精宏電熱干燥鼓風箱，上海精宏儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 假芝子實體的分子生物學鑒定和形態(tài)學鑒定 將野生子實體培養(yǎng)成菌絲，取菌絲0.5 g，用改良的CTAB法提取基因組DNA[15]，通用引物ITS1和ITS4擴增其ITS序列，送深圳華大測序獲得ITS序列，經(jīng)Chromas檢測后在Gen Bank中Blast N進行比對，下載相關(guān)序列用Mega 6.01建樹分析，分子鑒定后將ITS序列提交到GenBank獲取基因登錄號。形態(tài)鑒定按《中國靈芝科真菌資源與分布》進行。

1.2.2 假芝不同溶劑萃取物的制備 野生假芝子實體500 g干燥粉碎，按料液比1∶10加入95%乙醇，微波超聲30 min，4℃浸泡24 h，80℃水浴回流提取1 h，3次重復(fù)，合并乙醇提取液，50℃真空減壓濃縮得浸膏12.16 g；加適量水溶解浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，50℃減壓濃縮各部分萃取液，得石油醚提取物2 g、乙酸乙酯提取物0.5 g及正丁醇提取物0.3 g。

1.2.3 假芝醇提物的LC-MS/MS成分分析色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流動相A為0.1%甲酸-水；B相為乙腈。梯度洗脫程序：在0～6 min 內(nèi)，B相由10%溶液逐漸升至45%溶液；在6～12 min內(nèi)，由45%升至90%；在12～15 min內(nèi)，由90%降至10%。洗脫程序中流速為0.5 mL/min，柱溫為35℃，進樣體積為20 μL。

質(zhì)譜條件：正離子模式(ESI+)，電壓為4.0 kV；負離子模式(ESI-)，電壓為3.5 kV[16]。

1.2.4 MTT法檢測假芝不同溶劑提取物的抗腫瘤活性 將不同極性的乙醇、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物用DMSO配成20 mg/mL待用，HepG2和HCT-116細胞用DMEM(含10%FBS血清)培養(yǎng)至對數(shù)期，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，吸取100 μL接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋20 mg/mL的提取物至終濃度為12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，將96孔板中的細胞培養(yǎng)液吸出，向培養(yǎng)細胞中加入100 μL各濃度提取物，對照組和空白組均加等量的無血清培養(yǎng)基[17]。每處理設(shè)5個重復(fù)。培養(yǎng)48 h后，棄上清液，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再每孔加入DMSO 100 μL，充分振蕩10 min，于酶標儀490 nm下檢測吸光值A(chǔ)。按公式計算IC50值：

抑制率 =1-試驗組平均值A(chǔ)490/ 對照組平均值A(chǔ)490。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 Excel 2010統(tǒng)計數(shù)據(jù)，MassLynx 4.1分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，Graphpad Prism 5計算IC50半濃度效應(yīng)抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 假芝菌株的生物學特征及分子鑒定

從圖1可知，野生假芝子實體的菌蓋呈傘形至近圓形，直徑3～8 cm，厚 0.5～1.04 cm，與菌柄同色，具顯著同心環(huán)紋，無似漆樣光澤，邊緣鈍、薄。菌絲形態(tài)：初生菌絲新鮮時呈白色，隨著培養(yǎng)時間延長，由中心向邊緣逐漸變深褐色，菌絲斷裂處變紅色，并逐漸轉(zhuǎn)化為褐色，有明顯色變現(xiàn)象，野生假芝的菌絲體很容易在PDA培養(yǎng)基上分離純化和培養(yǎng)。孢子形態(tài)：擔孢子形狀為橢圓形，雙層壁，外壁無色透明，平滑，內(nèi)壁淡黃褐色，有微小刺，孢子大小為(1～3)μm ×(10～15)μm，符合皺蓋假芝形態(tài)特征。從圖2可知，冊亨假芝以100%的支持率與假芝Amaurodermarugosum(KJ654362)處于同一分支，從分子生物學鑒定該菌屬于假芝屬的假芝。

注：A為子實體， B為菌落形態(tài)特征，C為菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，D為孢子。

圖2 菌株MG021113基于ITS序列構(gòu)建的進化樹

2.2 假芝醇提物的LC-MS/MS成分

從表1可知，通過LC-MS/MS出峰圖譜順序，正離子模式下檢出11種物質(zhì)，其中1種為星魚甾醇，1種為脂肪酸，9個為未知物質(zhì)；負離子模式下檢出19種化合物，其中1種為原兒茶酸，10種為脂肪酸，8種為未知物質(zhì)。

表1 皺蓋假芝的LC-MS/MS出峰成分

2.3 假芝不同溶劑萃取物對細胞HCT-116和HepG2增殖抑制的IC50值

從表2可知，假芝不同溶劑萃取物對結(jié)腸癌細胞HCT-116增殖具有不同程度的抑制作用，其抑制率隨著提取液濃度的增加而增大。經(jīng)計算，假芝石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物的IC50值分別為156.60 μg/mL、1 183.00 μg/mL和136.20 μg/mL，其抑制活性依次為正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物，根據(jù)IC50值越小抑制效率越高，抑制結(jié)腸癌細胞HCT-116增殖表現(xiàn)最好的是正丁醇萃取物。

同樣，假芝不同溶劑萃取物對肝癌細胞HepG2增殖具有不同程度的抑制作用，假芝石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取的IC50值分別為69.85 μg/mL、121.10 μg/mL和98.77 μg/mL，其抑制活性依次為石油醚萃取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物，根據(jù)IC50值越小抑制效率越高，抑制肝癌細胞HepG2增殖最好的是石油醚萃取物。

表2 不同極性提取物對HCT-116和HepG2增殖的抑制作用

3 討論

對產(chǎn)自貴州西南地區(qū)的皺蓋假芝進行純培養(yǎng)和分離鑒定，提交其ITS序列到NCBI獲得基因號MG021113，一級菌絲經(jīng)PDA分離，長勢良好。肖自添等[18]對廣州分離到的野生假芝菌絲研究結(jié)果表明，液體菌種培養(yǎng)5 d即可用于生產(chǎn)，貴州分離到的皺蓋假芝可栽培特性也表現(xiàn)良好，可用于規(guī)?；a(chǎn)。皺蓋假芝子實體經(jīng)過粉碎和乙醇提取有效成分，相色譜液-串聯(lián)檢測發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下檢出11種主要化合物，在負離子模式下檢出19種化合物，此2種模式下能確定分子結(jié)構(gòu)的化合物有星魚甾醇和原兒茶酸，可鑒定成分以脂肪酸為主，還有部分未知化合物不能確定結(jié)構(gòu)。李向敏[19]對皺蓋假芝孢子粉的醇提取物氯仿部分離獲得2種具有抗腫瘤活性的脂肪酸、棕櫚酸和二十碳酸，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法獲得的成分大部分也是脂肪酸，說明脂肪酸在藥理活性中具有重要的活性作用，未來可深入研究其機理作用。同時，皺蓋假芝不同溶劑提取物采用MTT法對2株腫瘤細胞檢測發(fā)現(xiàn)，石油醚提取物對人肝癌細胞HepG2生長具有良好抑制活性，其IC50值為69.85 μg/mL；正丁醇提取物對人結(jié)腸癌細胞HCT-116增殖抑制作用好，其IC50值為132.6 μg/mL，可見，皺蓋假芝雖然不含靈芝科特有的活性成分靈芝酸，但對腫瘤細胞生長仍具有不同程度的抑制作用。

4 結(jié)論

貴州黔西南地區(qū)所產(chǎn)野生皺蓋假芝可在實驗室分離純化，可栽培性表現(xiàn)良好；子實體的醇提物經(jīng)LC-MS/MS分析，主要成分為脂肪酸。假芝子實體用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取后經(jīng)MTT法檢測，均對人類腫瘤細胞HCT-116和HepG2增殖具有不同程度的抑制作用。該結(jié)果為貴州野生皺蓋假芝的進一步開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。