周 夢， 余 米， 張承露， 封孝蘭， 鄭永華

(1.重慶市藥物種植研究所， 重慶 南川 408435； 2.西南大學 動物科技學院， 重慶 北碚 400715)

0 引言

【研究意義】雜交鱧(Channamaculata♀×C.argus♂)是由烏鱧(Channaargus)與斑鱧(Channamaculata)人工雜交而成的子一代，因其具有良好的雜種優(yōu)勢，且具有肉質(zhì)細膩、味道鮮美、刺少和出肉率高等特點，深受國內(nèi)外消費者的喜愛。雜交鱧還具有補脾利水、去瘀生新等藥用價值，可作為創(chuàng)傷、手術后滋補調(diào)養(yǎng)的食療材料，使得雜交鱧成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種[1-3]。但隨著養(yǎng)殖戶開始采用大規(guī)模、高密度的人工養(yǎng)殖模式，導致各種疾病頻發(fā)，其中由舒伯特氣單胞菌感染引起的內(nèi)臟類結節(jié)病是鱧科魚類常見疾病之一。舒伯特氣單胞菌為氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromanas)，為革蘭氏陰性桿菌。該菌廣泛存在于淡水、海水、土壤、魚類和脊椎動物中，既可引起人類皮膚和軟組織感染、壞死性筋膜炎敗血癥等，亦可引起養(yǎng)殖魚類的內(nèi)臟類結節(jié)病，是一種人畜魚共患條件性致病菌[4-5]。當前對魚源舒伯特氣單胞菌的防治主要采用抗生素抑殺病原菌，由此造成的環(huán)境污染及細菌耐藥性問題對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)乃至整個生態(tài)環(huán)境都存在巨大隱患。中草藥作為在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的藥物，不僅具有資源豐富、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，還具有抗菌、增強免疫等作用。選擇防治效果好的中藥材應用于舒伯特氣單胞菌的防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】當前對水產(chǎn)養(yǎng)殖中舒伯特氣單胞菌的研究主要集中在病原菌的分離鑒定及快速檢測方法[6-7]等方面?！狙芯壳腥朦c】利用中草藥防治魚類細菌性疾病[8-11]備受關注，但目前針對中草藥體外抑制舒伯特氣單胞菌作用的報道相對較少。【擬解決的關鍵問題】選取60 種中草藥，研究其對雜交鱧源舒伯特氣單胞菌的體外抑菌作用，以期為防治雜交鱧源舒伯特氣單胞菌誘發(fā)的疾病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中草藥 試驗選用60種中草藥作為研究對象，試驗中草藥及其供試部位詳見表1，所用中草藥均購自重慶北碚萬和大藥房。

表1 60種中草藥名錄

續(xù)表1

1.1.2 受試菌種 菌株：舒伯特氣單胞菌(Aeromonasschubertii)菌株WL-1，由中國水產(chǎn)科學研究所珠江水產(chǎn)研究所分離鑒定和保存提供。

1.1.3 試劑 試驗用瓊脂粉、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇，購自成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏和蛋白胨，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸膏，購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.2 方法

1.2.1 中草藥提取液的制備 試驗中草藥提取液制備采用煎煮方法。將購置的中草藥置于恒溫箱65(±5) ℃下干燥5 h；用粉碎機將干燥后的中草藥進行粉碎，然后每種中草藥取10 g放入潔凈燒杯中，按1∶10加水浸泡30 min，再放置電爐上煎煮30 min。用紗布將煎煮完的藥液過濾，重復此過程3 次，分別得到3 次藥液。將所得藥液合并，蒸餾濃縮至藥液內(nèi)含原藥1 g/mL。最后用高壓滅菌鍋(121℃，20 min)滅菌后，置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液的制備 試驗菌培養(yǎng)：將菌株活化，用接種針在固體培養(yǎng)基上劃線，再28℃培養(yǎng)24 h后，挑取單個菌落，接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)24 h。采用平板計數(shù)法將菌液稀釋到合適濃度，菌液濃度為1×108CFU/mL。

1.2.3 抑菌圈的測定 采用瓊脂擴散法[12]，先使用無菌棉簽蘸取濃度約為1×107CFU/mL的菌液輕輕的均勻涂抹在平板培養(yǎng)基上，再用打孔器(直徑為6.00 mm)在平板上均勻打孔，每個平板上打4 個孔，挑出孔內(nèi)瓊脂并用火焰封底，做好標記。每孔加入100 μL(1 g/mL)藥液，然后將之放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；平板取出后，觀察孔周圍是否有抑菌圈，若有，則用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每種藥物3次重復，同時以無菌水做空白對照。結果判斷按《中藥藥理學》[13]介紹的標準：抑菌圈≥20 mm，屬于極敏；抑菌圈15 ～ 19 mm為高敏；抑菌圈10 ～ 14 mm屬于中敏；抑菌圈小于10 mm，屬于低敏；沒有抑菌圈，屬于不敏(無抑菌效果)。

1.2.4 最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度的測定 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基以二倍稀釋法[14]對提取物進行梯度稀釋，取滅菌有硅膠塞的試管10 支，編號，每管先加入無菌肉湯培養(yǎng)基 2.0 mL，然后于第1 管中加入滅菌的受試藥液2.0 mL，混勻后取出2.0 mL放入第2 管中，依次稀釋成8 個2 倍系列濃度，第9 管不加藥液，作陽性對照，最后加入細菌懸液，使細菌濃度達106CFU/mL，第10 管加受試藥液2.0 mL，混勻后取出2.0 mL棄去，不加細菌，作為陰性對照。于28℃，200 r/min搖床中震蕩培養(yǎng)24 h，然后取出與對照管對比觀察，無混濁現(xiàn)象所對應的藥物濃度為該中草藥對舒伯特氣單胞菌的最小抑菌濃度，每個濃度重復3 次。在MIC試驗基礎上，搖動混勻試管中菌液后于28℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察結果，清澈透明無渾濁現(xiàn)象的試管即為無菌生長試管，無菌生長試管中的最低藥物濃度，即為最小殺菌濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行處理，結果均用平均值±標準差(X±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 中草藥的抑菌效果

從表2可知，60 種中草藥提取液對舒伯特氣單胞菌的抑菌效果各不相同。在1 g/mL濃度下，60種中草藥中五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅的抑菌效果最顯著，其抑菌圈直徑均大于20 mm， 為極敏藥物；其中威靈仙、千里光、虎杖、石榴皮、黃芩、毛冬青、連翹和厚樸8 種中草藥的抑菌效果次之，其抑菌圈直徑在15 ～ 20 mm，屬于高敏藥物；魚腥草、薄荷、赤芍、白芍、筋骨草、夏枯草、紫花地丁、檳榔、甘草9 種中草藥抑菌效果較差，抑菌圈直徑在10 ～ 15 mm，屬于中敏藥物；仙鶴草、馬兜鈴、茵陳蒿3 種中草藥抑菌效果不明顯，抑菌圈直徑小于10 mm，屬于低敏藥物；剩余大青葉等29 種中草藥無抑菌效果。因此，初步篩選出五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅11 種抑菌效果較好的中草藥。

表2 60種中草藥提取液對舒伯特氣單胞菌的抑菌圈直徑及抑菌等級

續(xù)表2

2.2 最小抑菌及殺菌濃度

從表3可知，五倍子的抑菌殺菌效果最好，其MIC和MBC均為1.95 mg/mL；其次為訶子、烏梅、地榆、黃連、兒茶和丁香，其MIC和MBC分別為1.95 mg/mL和3.91 mg/mL、3.91 mg/mL和3.91 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL；再次，木瓜、五味子的MIC和MBC均為15.63 mg/mL和15.63 mg/mL；大黃和黃柏的MIC和MBC分別為31.25 mg/mL和31.25 mg/mL、62.50 mg/mL和62.50 mg/mL，抑菌效果較差。

表3 11種中草藥提取液對舒伯特氣單胞菌的最小抑菌及殺菌濃度

3 討論

舒伯特氣單胞菌是一種新型的人、獸、魚共患致病菌，對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成嚴重威脅，而現(xiàn)有的藥物防控效果不理想。為有效防控該病，試驗以患病雜交鱧體內(nèi)分離的舒伯特氣單胞菌為供試菌，采用瓊脂擴散法對60 種中草藥進行抑菌中草藥篩選。結果表明，五倍子、大黃、黃柏、黃連、地榆、丁香、木瓜、訶子、五味子、兒茶、烏梅11 種中草藥抑菌效果較好。采用二倍稀釋法測定篩選出的抑菌作用較好的中草藥水提物對雜交鱧源舒伯特氣單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度結果表明，五倍子抑菌效果最好，對舒伯特氣單胞菌的MIC和MBC均為1.95 mg/mL，訶子、烏梅、黃連、地榆、丁香、兒茶、木瓜、五味子、大黃、黃柏的MIC和MBC分別為1.95 mg/mL和3.91 mg/mL、3.91 mg/mL和3.91 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、15.63 mg/mL和15.63 mg/mL、15.63 mg/mL和15.63 mg/mL、31.25 mg/mL和31.25 mg/mL、62.5 mg/mL和62.5 mg/mL。研究結果既為開發(fā)潛在的防治舒伯特氣單胞菌的藥物提供了科學依據(jù)，也為進一步篩選出具有高效、低副作用的中草藥復方奠定了基礎，在健康養(yǎng)殖中具有較好的應用前景。

試驗從60 種中草藥中篩選出31 種具有抑菌效果的中草藥，其中烏梅等28 種中草藥對供試菌株的敏感度達中敏以上。這些中草藥在現(xiàn)代藥理研究中已證實都有明顯的抗菌作用[9-15]。但其抑菌強弱有所不同，五倍子等11 種中草藥水提物的抑菌效果較好，其抑菌圈直徑均達20 mm以上。這主要是由于每種中草藥有效成分的種類、含量以及抑菌機制存在差異，導致抑菌效果有所不同。其中，烏梅的抑菌效果最強，抑菌圈直徑達28.62 mm。烏梅含有的成分復雜多樣，如烏梅醇、有機酸等，有可能在烏梅抑菌和殺菌過程中起到了主要作用，也可能是多個水平的共同作用，從而達到抑菌的目的。夏與晴等[16]研究發(fā)現(xiàn)，烏梅抑制嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑為12.38 mm。李蘊玉等[17]研究顯示，烏梅對雞致病性綠膿桿菌分離株H2的抑菌圈直徑為24.5 mm。說明同一種中草藥對不同致病菌的抑菌效果也有一定差異，原因可能是起作用的有效成分不同，亦或是抑菌機制不同造成的。

試驗結果表明，五倍子的MIC和MBC均為1.95 mg/mL，抑菌、殺菌效果最好。該結果與瓊脂擴散法測定的抑菌圈結果不一致。這可能是由于各中草藥水提物在平板上的擴散能力不同，烏梅水提物在平板上擴散能力較強，且在其擴散范圍內(nèi)能抑制細菌的生長，所以形成的抑菌圈較大。雖然五倍子水提物對舒伯特氣單胞菌的抑菌效果可能強于烏梅水提物，但其在平板上的擴散能力低于烏梅水提物，導致其抑菌圈也較小。因此，需要結合多種方法加以評價某種中草藥的體外抑菌效果，而不能僅以單一方法進行評價。

有研究發(fā)現(xiàn)，中草藥的抑菌、殺菌效果與其含有的抗菌有效成分密切相關，中草藥的有效活性成分主要包括生物堿類、醌類、有機酸類、黃酮類、鞣質(zhì)類、活性多糖類等[18-27]。但中草藥活性成分在體外和體內(nèi)的作用環(huán)境下相差甚大，而研究僅在體外進行中草藥抑菌效果評估，因此還需結合動物體內(nèi)試驗進一步評價，以期開發(fā)為漁藥。

4 結論

抑菌殺菌效果最好的是五倍子，其最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均為1.95 mg/mL，其次是訶子、烏梅、地榆、黃連、兒茶和丁香，再次是木瓜和五味子；大黃和黃柏較差。