劉 倩 張 靜 韓福國 范雪梅 郝艷麗 史 云 劉清飛*

1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院(咸陽，712046)；2.清華大學藥學院；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院

在中醫(yī)理論體系中，宮頸HPV感染屬于“帶下病”,用藥方面通過內(nèi)服清熱利濕解毒類藥物直接清除病毒和提高免疫力達到治療目的或通過外用藥改善局部免疫環(huán)境而協(xié)助機體清除病毒[1]?？祴D凝膠為中藥制劑，局部涂抹給藥，其由白芷、蛇床子、花椒、土木香、冰片5種中藥材組成，可抗病毒又可提高免疫[2],臨床已用康婦凝膠治療宮頸HPV感染[3]，但分子作用機制尚無深入研究。網(wǎng)絡藥理學是從系統(tǒng)和網(wǎng)絡整體層面解釋藥物系統(tǒng)藥理機制的一門交叉學科，與中醫(yī)藥的“網(wǎng)絡靶標-多成分藥物”及整體性特點不謀而合[4-6]。本文運用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術探討康婦凝膠治療宮頸HPV感染的復雜網(wǎng)絡關系，明確其藥效物質(zhì)基礎及分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫及軟件

TCMSP、Pubchem、SwissTargetPrediction、BATMAN-TCM等活性成分預測數(shù)據(jù)庫；OMIM、GeneCards、DisGeNET等疾病靶標數(shù)據(jù)庫；Uniprot、RCSBPOB等靶點信息數(shù)據(jù)庫DAVID、微生信、DEGG、String、Cytoscape 3.7.2、KNIME 4.3.1、Autodock vina、pymol、Chem 3D等結(jié)果分析軟件。

1.2 活性成分及靶點篩選

分別以白芷、蛇床子、花椒、冰片、土木香為關鍵詞在TCMSP中檢索其活性成分和相關靶點?？诜锢枚?OB)主要用于口服藥物，而康婦凝膠給藥方式為局部涂于外陰、陰道處，經(jīng)黏膜吸收而發(fā)揮藥效。藥物透過黏膜后能夠迅速入血，經(jīng)血液循環(huán)到達全身或靶點，無需經(jīng)過肝臟，一定程度上能夠提高藥物生物利用度[7]，因此本文在TCMSP中以類藥性DL(Drug Likeness)≥0.18為篩選標準檢索活性成分及靶點，并在Pubchem得候選成分的SMILES字符串，導入SwissTargetPrediction平臺，設置屬性為”homo sapiens”，選取Probability≥0.85全部預測靶點或Probability≤0.85的前15個蛋白靶點作為該成分有效預測靶點。用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫按Score cutoff≥20且P-value<0.05檢索土木香的活性成分及對應靶點。結(jié)合Uniprot，校正得到中藥活性成分相關靶點。

1.3 宮頸HPV感染相關靶點篩選

通過OMIM、GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫，以“Cervical HPV Infection”“Cervical Human Papillomavirus Infection”與“Cervical Human Papilloma Virus Infection”為檢索詞進行檢索，對檢索結(jié)果進行整合去冗余后獲得宮頸HPV感染相關靶點。

1.4 宮頸HPV感染的潛在作用靶點篩選

運用微生信平臺繪制韋恩圖，取康婦凝膠活性成分作用靶點與宮頸HPV致病相關靶點的交集，作為康婦凝膠治療宮頸HPV感染的潛在作用靶點。

1.5 PPI網(wǎng)絡與可視化網(wǎng)絡的構建

將1.4潛在作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫，以物種“Homo sapiens”、高可信度≥0.7作為篩選條件，得蛋白間相互作用關系，再運用Cytoscape(3.7.2)進行可視化，根據(jù)網(wǎng)絡中度值、介度、緊密度等進行排序，篩選核心靶點。

1.6 GO生物過程與KEGG通路富集分析

將潛在作用靶點基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進一步分析其相關生物過程及作用通路，富集結(jié)果按P值由小到大(P<0.05)排序，GO分析選前10個結(jié)果，KEGG選前20個通路進行分析和展示。運用KEGG數(shù)據(jù)庫進行注釋以及通路圖分析。

1.7 “藥物成分-作用靶點-作用通路”網(wǎng)絡圖

運用KNIME軟件獲得前20條通路相關靶點對應的化學成分，得到活性成分-通路相關靶點-通路對應關系，導入Cytoscape構建“藥物成分-作用靶點-作用通路”網(wǎng)絡圖，根據(jù)度值篩選主要活性成分。

1.8 分子對接

采用Autodock vina軟件對排名前5的核心靶點與1.7中對應活性成分進行分子對接驗證。從RCSB PDB蛋白質(zhì)結(jié)構數(shù)據(jù)庫得靶點蛋白三維結(jié)構并保存為pdb格式，Pubchem數(shù)據(jù)庫導出化合物三維結(jié)構SDF格式，在chem3D中轉(zhuǎn)化成mol2格式。采用AutoDock Tools對上述蛋白受體進行去水加氫、計算電荷后存為pdbqt格式。再運用插件Autogrid得到活性口袋，進行分子對接，最后用pymol可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 康婦凝膠活性成分篩選

TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中共篩選得到來自白芷、蛇床子、冰片、花椒、土木香的活性成分數(shù)量分別為45、29、5、8、4個，潛在作用靶點整合去重后得到512個。

2.2 宮頸HPV感染相關靶點基因篩選

從OMIM、GeneCard、DisGeNET疾病基因數(shù)據(jù)庫分別檢索得261、1913、429個宮頸HPV感染相關靶點，整合去重得2275個。

2.3 康婦凝膠治療宮頸HPV潛在作用靶點篩選

將活性成分作用靶點與宮頸HPV致病相關靶點導入微生信在線平臺得交集靶點，如圖1所示(2725頁)，交集基因239個，占總基因數(shù)的9.4%，為康婦凝膠治療宮頸HPV感染的潛在作用靶點。

2.4 潛在作用靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡分析

在String數(shù)據(jù)庫導入239個潛在作用靶點進行PPI網(wǎng)絡分析，結(jié)果用Cytoscape可視化，包含229個靶點、2315條邊。以度值≥2倍中位數(shù)即度值≥30篩得54個候選靶點，進而以度值、介度、緊密度≥中位數(shù)篩選出22個核心靶點，見圖2(2725頁)，其中顏色越深表明degree值越大。

2.5 交集靶點富集分析

2.5.1 GO分析通過DAVID進行GO功能富集分析，得顯著性GO條目835個，其中生物過程(BP)條目643個，細胞組成(CC)條目72個，分子功能(MF)條目120個，分別占77.0%、8.6%、14.4%。圖3(2725頁)為BP、CC及MF富集結(jié)果中顯著性最高的10條功能。BP方面主要參與對藥物的反應性、凋亡過程負調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等；CC方面主要參與胞質(zhì)溶膠、細胞外空間、核質(zhì)等；MF方面主要參與蛋白激酶活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合等，表明康婦凝膠參與體內(nèi)多種生物學調(diào)控過程以發(fā)揮防治HPV感染的作用。

2.5.2 KEGG分析239個潛在作用靶點經(jīng)DAVID通路富集分析得126條顯著富集通路，運用KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路注釋分析，結(jié)果見圖4(2725頁)。潛在作用靶點顯著富集的信號通路有PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、TNF、ErbB等信號通路。根據(jù)現(xiàn)有與宮頸HPV感染相關的作用機制研究[8-12]，在富集得126條通路中選擇與宮頸HPV感染最為相關的5條信號通路進行整合，構建了康婦凝膠治療宮頸HPV感染的信號通路調(diào)控網(wǎng)絡圖，見圖5(2726頁)。

2.6 “藥物成分-作用靶點-作用通路”網(wǎng)絡構建

KNIME得20條通路136個相關基因?qū)?0個活性成分，導入Cytoscape中構建“藥物成分-作用靶點-作用通路-疾病”網(wǎng)絡圖，見圖6(2726頁)。該網(wǎng)絡涉及236個節(jié)點和1197條邊，平均度值為6.09，大于平均度值的活性成分共有20個(表1)，提示這20種成分可能為康婦凝膠治療宮頸HPV感染的主要活性成分。其中槲皮素、(E)-2,3-二(7-甲氧基-2-氧代-8-色烯基)丙-2-烯醛、黃木亭、β-谷甾醇和二氫歐山芹醇醋酸酯為度值最高的5個活性成分。

表1 康婦凝膠20個核心成分相關參數(shù)

2.7 分子對接

為了驗證網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果的準確性，將排名前5的核心靶點(TP53、AKT1、STAT3、HSP90AA1、EGFR)與其對應主要活性成分進行分子對接，部分結(jié)果見表2，部分可視化結(jié)果見圖7(2726頁)。靶點與活性成分的結(jié)合能越小越好，結(jié)合能<-5kJ/mol，表明二者具有較好的結(jié)合活性，<-7kJ/mol表明二者的結(jié)合構型有強烈的結(jié)合活性。核心靶點均與對應活性成分大多形成氫鍵且均有較好的結(jié)合活性。其中，槲皮素與TP53以及EGFR結(jié)合作用最強，均為-8.0kJ/mol，HSP90AA1與多數(shù)活性成分均有較好對接作用。不同靶點作用相同化學成分，不同化學成分又可作用相同靶點，充分提現(xiàn)了康婦凝膠能夠多成分-多靶點治療宮頸HPV感染。

表2 核心靶點與部分對應活性成分對接結(jié)合能及氫鍵數(shù)

3 討論

HPV感染較為廣泛，女性一生有70%～80%可能性感染HPV[13]。本文通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術預測了康婦凝膠治療宮頸HPV感染的藥效物質(zhì)基礎及分子作用機制。數(shù)據(jù)庫篩選得91個活性成分以及239個作用靶點，再通過網(wǎng)絡圖及分子對接實驗證實槲皮素、β-谷甾醇等化學成分可能為治療宮頸HPV感染的化學成分。槲皮素是花椒中一種黃酮類化合物，已研究出其抗炎，抗癌等作用[14]。在單層細胞培養(yǎng)中槲皮素可抑制多種病毒對細胞的感染，可通過拮抗宿主細胞的Ca2+通道阻止病毒進入細胞而達到抗病毒作用，還可抑制病毒在細胞內(nèi)復制[15]。另一方面也可以通過刺激細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控機體的炎癥反應以及免疫應答[16]。β-谷甾醇是白芷、花椒、蛇床子的共有成分，可通過促進IFN mRNA表達并促進其下游相關抗病毒基因表達發(fā)揮抗病毒作用[17]。

通過PPI網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)篩選得TP53、AKT1、STAT3、HSP90AA1和EGFR可能為康婦凝膠治療宮頸HPV感染的核心靶點。p53是一種腫瘤抑制基因，高危HPV E6蛋白可直接作用于p53核心位點，導致其介導細胞周期停滯和凋亡功能喪失[18]，而低危HPV由于E6蛋白只分布于細胞核內(nèi)，將p53隔于細胞質(zhì)中，不能靶向降解p53。這也使高低危HPV在降解p53時有差異性[19]。高危HPV E6可通過IL-6異常升高激活STAT3轉(zhuǎn)錄因子而使細胞癌變[20]。HSP90蛋白可作為分子伴侶與癌癥基因DNA結(jié)合，激活其抗腫瘤作用，有研究已驗證HPV16 E7與HPS90融合制成的DNA疫苗可促進宮頸癌細胞凋亡也可直接殺傷癌細胞發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。宮頸癌病變部位的表皮生長因子受體(EGFR)高表達且表達水平與HPV感染復發(fā)有密切關系[22]。有研究表明EGFR抑制劑TK1可抑制EGFR和AKT磷酸化作用以及阻斷JAK/STAT通路進而抑制宮頸癌HeLa細胞增值[23]。

GO結(jié)果顯示這些靶點基因可通過參與對藥物的反應性、凋亡過程負調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程；影響胞質(zhì)溶膠、細胞外空間、核質(zhì)等細胞部分；調(diào)控蛋白激酶活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合等分子生物功能協(xié)同發(fā)揮抗宮頸HPV感染的作用。KEGG富集分析結(jié)果表明康婦凝膠治療宮頸HPV感染涉及PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、TNF信號通路及ErbB信號通路等相關通路，展現(xiàn)出康婦凝膠治療宮頸HPV感染“多靶點、多通路”的特點。其中最為主要的通路為P13K/Akt信號通路，AKT1既是通路中的關鍵分子也是康婦凝膠潛在作用靶點。有研究表明，HPV16感染與PI3K、AKT1、NF-κB表達成正相關，持續(xù)感染可以導致PI3K-AKT信號通路被激活，進一步導致宮頸病變[8]。真核細胞自噬功能可降解自身受損蛋白質(zhì)和細胞內(nèi)病原體，因此在防御病毒感染方面起重要作用。HPV 16感染角質(zhì)細胞后E6/E7蛋白同時表達可通過激活PI3K/AKT/mTOR通路而抑制自噬功能[24]。但也有研究表明，HPV11 E6蛋白過表達也可抑制AKT/mTOR和Rrk/mTOR通路而激活自噬[25]。有研究將HPV11 E6和HPV18 E6基因克隆于HaCaT細胞中表達，發(fā)現(xiàn)HPV11 E6和HPV18 E6蛋白通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路以及其他DNA損傷修復、細胞存活、增值等通路啟動細胞轉(zhuǎn)化。雖HPV11和HPV18的E6蛋白有相似的影響，但高危HPV18E6的水平明顯要高很多[26]。

綜上可述，本研究運用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術揭示了康婦凝膠治療宮頸HPV感染的活性成分、作用靶點以及分子作用機制，體現(xiàn)其多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的特點。隨著對網(wǎng)絡藥理學所涉及的數(shù)據(jù)庫、方法、應用不斷完善，網(wǎng)絡藥理學在揭示中藥物質(zhì)基礎與分子作用機制方面的優(yōu)勢必將更加明顯[27-28]，特別是針對當前網(wǎng)絡藥理學研究尚存在數(shù)據(jù)缺乏標準化、科學驗證不足等問題，2021年，首個網(wǎng)絡藥理學國際標準正式制訂并發(fā)布[29]，必將進一步促進網(wǎng)絡藥理學研究的專業(yè)化、標準化以及廣泛應用。