崔妍婷，楊璐愷，劉 金，韓亦龍，陳 超，鄧曉惠，蔣利剛

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院不孕不育診療中心，濟(jì)南 250012

近年來女性癌癥發(fā)病年齡趨于年輕化，許多患者在確診時(shí)仍有生育要求[1]，然而癌癥治療會(huì)造成不同程度的卵巢組織損傷，甚至卵巢衰竭。卵巢組織冷凍作為生育力保存方法之一，具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前已有130余名嬰兒通過此技術(shù)誕生[2]。卵巢組織冷凍方法主要有兩種，相較于出現(xiàn)較早的慢速程序化冷凍，玻璃化冷凍因其操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。玻璃化冷凍能夠迅速通過冷凍敏感區(qū)，最大程度減少冰晶形成對(duì)細(xì)胞的機(jī)械性損傷和凍融效應(yīng)[3]?？焖俳禍厥遣ＡЩ鋬鰷p少組織損傷的關(guān)鍵，封閉式冷凍載體管壁較厚，影響降溫速率，冷凍保存效果不理想[4]。本研究采用自研載體進(jìn)行玻璃化冷凍，以探討自研載體在羊卵巢冷凍中的效果。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組于山東省濟(jì)南市小寨屠宰場(chǎng)選取8～10月、體重約30 kg的未孕母羊16只，共獲取32只羊卵巢。獲取的卵巢組織置于杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)中，4 ℃條件下，2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。去除髓質(zhì)保留卵巢皮質(zhì)厚約1 mm，切成8 mm×4 mm×1 mm大小的組織塊，磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗3次，整個(gè)處理過程于冰板上進(jìn)行。共獲取卵巢皮質(zhì)64塊，通過簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方式分為新鮮組、程序化冷凍組、自研載體I玻璃化冷凍組及自研載體Ⅱ玻璃化冷凍組，每組各16塊皮質(zhì)，其中8塊用于體外培養(yǎng)，另外8塊用于制作石蠟切片。

主要試劑及材料二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、乙二醇(ethylene glycol，EG)、DPBS、蔗糖、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)等均購自Sigma公司；MEM培養(yǎng)液(美國HyClone公司)；重組卵泡刺激素(recombinant-follicle stimulating hormone，r-FSH)(長(zhǎng)春金賽藥業(yè)股份有限公司)；10 ml/L胰島素鐵硒傳遞蛋白(insulin transferrin selenium，ITS)(Gibco)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(瑞士羅氏公司)；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司)。

自研載體由冷凍管及承載部?jī)刹糠謽?gòu)成，卵巢組織平鋪于承載部，在液氮平面以下將承載部放入冷凍管，擰上冷凍管帽。既保持良好的密封性，防止卵巢組織的交叉感染，同時(shí)也方便使用者操作。自研載體I的承載部為80目不銹鋼金屬篩網(wǎng)，大小為2.0 cm×0.5 cm；自研載體Ⅱ承載部為聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯塑料超薄載體片，大小為1.8 cm×0.6 cm，載體片上有3列小孔，直徑為0.8 mm，孔間距為0.8 mm。

卵巢組織的程序化冷凍及復(fù)蘇程序化冷凍與玻璃化冷凍的基礎(chǔ)液均為DPBS+10% FBS。將卵巢組織放入裝有冷凍液(基礎(chǔ)液+10% DMSO)的冷凍管中，2 ℃預(yù)冷30 min。參照Gosden等[5]建立的程序化冷凍方法。

卵巢組織的玻璃化冷凍及復(fù)蘇采用Kagawa等[6]描述的方法并加以改進(jìn)。室溫下依次放入平衡液(基礎(chǔ)液+7.5% DMSO+7.5% EG)中25 min，冷凍液(基礎(chǔ)液+20% DMSO+20% EG+0.5 mol/L蔗糖)中15 min，將組織平鋪于自研載體上，置入液氮中快速晃動(dòng)，液氮停止沸騰后，在液氮平面下裝入冷凍管中。14 d后解凍，解凍時(shí)在空氣中停留10～20 s，放入37℃水浴箱中的復(fù)蘇液1(基礎(chǔ)液+1 mol/L蔗糖)1 min，再依次放入常溫復(fù)蘇液2(DPBS+0.5 mol/L蔗糖)、基礎(chǔ)液各5 min。

卵巢組織體外培養(yǎng)培養(yǎng)液主要成分為5% FBS、0.5 IU/ml r-FSH、1% ITS、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素、MEM培養(yǎng)液，將卵巢組織處理成2 mm×2 mm×1 mm大小，每組40塊，通過簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方式均分成8小組，放入12孔板中，每孔加培養(yǎng)液2 ml，于37℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天測(cè)培養(yǎng)液內(nèi)雌激素含量，每次測(cè)量取0.5 ml培養(yǎng)液并補(bǔ)充等量培養(yǎng)液。使用羅氏自動(dòng)生化分析儀測(cè)定雌激素水平。

卵巢組織形態(tài)學(xué)分析將各組卵巢組織進(jìn)行常規(guī)固定、包埋后4 μm厚連續(xù)切片行HE、PCNA及TUNEL染色，在光學(xué)顯微鏡下(×200)統(tǒng)計(jì)正常形態(tài)及異常形態(tài)的原始和初級(jí)卵泡數(shù)。卵母細(xì)胞完整、核仁清晰、顆粒細(xì)胞排列規(guī)則為形態(tài)正常卵泡；卵母細(xì)胞皺縮、核固縮、胞質(zhì)內(nèi)可見空泡、顆粒細(xì)胞排列紊亂為形態(tài)異常卵泡。為避免重復(fù)計(jì)數(shù)，只計(jì)數(shù)有核細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，每組8張切片，共80個(gè)視野。卵泡分類標(biāo)準(zhǔn)參考Gougeon分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]。原始卵泡是指單層扁平或扁平與立方混合的顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞；初級(jí)卵泡是指單層立方型顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞。

卵巢組織PCNA表達(dá)檢測(cè)采用組織學(xué)切片的Envision二步法操作測(cè)定。每組8張切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，共80個(gè)視野。在光學(xué)顯微鏡下(×200)計(jì)數(shù)PCNA表達(dá)陽性及陰性卵泡數(shù)。卵母細(xì)胞核呈棕黃色時(shí)視為PCNA蛋白表達(dá)陽性，PCNA陽性率=(PCNA陽性卵泡數(shù)/總卵泡數(shù))×100%。

卵巢組織凋亡檢測(cè)卵巢組織凋亡檢測(cè)采用TUNEL法檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。凋亡細(xì)胞核為棕黃色(包括卵泡及間質(zhì)細(xì)胞)，定義為TUNEL陽性。每組共8張切片，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)高倍鏡視野圖，通過Image-pro Plus 6.0軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞[8]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用 SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，4組間卵泡正常形態(tài)率、PCNA陽性率采用卡方檢驗(yàn)分析；凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較采用單因素方差分析，體外培養(yǎng)雌二醇采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用最小顯著性差異法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

體外培養(yǎng)雌激素濃度新鮮組及冷凍復(fù)蘇各組卵巢組織體外培養(yǎng)9 d，雌激素隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增長(zhǎng)，冷凍復(fù)蘇各組與新鮮組雌激素濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.363，P=0.780)(圖1)。

冷凍前后組織形態(tài)學(xué)HE染色切片顯示，各級(jí)卵泡在卵巢組織中分布不均，以原始卵泡為主，其次為初級(jí)卵泡。各組卵巢組織均存在形態(tài)正常的卵泡和閉鎖的卵泡，大部分卵泡在凍融后可以維持正常形態(tài)。解凍后異常卵泡表現(xiàn)為卵泡形態(tài)不規(guī)則，顆粒細(xì)胞分散、不連續(xù)、核固縮等(圖2)。4組原始卵泡及初級(jí)卵泡形態(tài)正常率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)；經(jīng)多重比較并對(duì)P值進(jìn)行校正后顯示新鮮組原始卵泡形態(tài)正常率明顯高于程序化冷凍組、自研載體I玻璃化冷凍組和自研載體Ⅱ玻璃化冷凍組(P=0.030，P=0.012，P=0.006)，冷凍復(fù)蘇各組原始卵泡形態(tài)正常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)；程序化冷凍組初級(jí)卵泡正常形態(tài)率明顯低于新鮮組(P=0.000)，自研載體I玻璃化冷凍組及自研載體Ⅱ玻璃化冷凍組初級(jí)卵泡正常形態(tài)率與新鮮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000，P=0.972)，程序化冷凍組與自研載體I玻璃化冷凍組及自研載體Ⅱ玻璃化冷凍組初級(jí)卵泡形態(tài)正常率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.133，P=0.246)(表1)。

圖1 卵巢組織體外培養(yǎng)的雌二醇濃度

卵巢組織PCNA表達(dá)結(jié)果各組卵巢組織中均可見到PCNA陽性表達(dá)(圖2)。新鮮組、程序化冷凍組、自研載體I玻璃化冷凍組及自研載體Ⅱ玻璃化冷凍組PCNA陽性表達(dá)率分別為17.2%、15.6%、16.7%及16.4%。各組卵泡PCNA陽性表達(dá)率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.949)。

卵巢組織凋亡情況TUNEL反應(yīng)陽性的細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，各組均有不同程度的細(xì)胞凋亡，但冷凍細(xì)胞凋亡水平比新鮮組明顯增加(圖2)。冷凍復(fù)蘇各組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯高于新鮮組(13.88±8.96)(F=37.584，P=0.000)，程序化冷凍組細(xì)胞凋亡數(shù)目(129.21±51.06)明顯高于采用自研載體I玻璃化冷凍組(64.08±37.38)及自研載體Ⅱ玻璃化冷凍組(60.63±40.69)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.992，P=0.000)。

表1 4組卵巢組織形態(tài)學(xué)分析(%)

PCNA：增殖細(xì)胞核抗原；TUNEL；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記；→：示正常原始卵泡；↑：示正常初級(jí)卵泡；↓：示異常原始卵泡；←：示異常初級(jí)卵泡；：示PCNA表達(dá)陽性的卵泡；：示PCNA表達(dá)陰性的卵泡

討 論

玻璃化冷凍是采用較高濃度的冷凍保護(hù)劑減少組織及細(xì)胞內(nèi)水分含量，然后快速冷凍。在非?？斓睦鋬鏊俾氏?，與冷凍保護(hù)劑混合的水分子無法排列成晶體結(jié)構(gòu)，而是形成一種玻璃化的黏稠狀態(tài)，減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成，從而減少細(xì)胞冷凍損傷[9- 10]?？焖俳禍厥遣ＡЩ鋬黾夹g(shù)減少組織冷凍損傷的關(guān)鍵，而載體選擇十分重要。目前玻璃化卵巢冷凍使用的冷凍載體主要有(1)開放式載體：卵巢組織直接與液氮接觸，主要有冷凍環(huán)、冷凍載桿、細(xì)胞篩網(wǎng)、針刺式載體等；(2)封閉式載體：卵巢組織不與液氮直接接觸，主要有冷凍袋、冷凍管、麥管等[11- 12]。封閉式載體由于管壁較厚，溫度傳導(dǎo)慢，大大降低冷凍速率，影響卵巢冷凍效果，且只能冷凍較小的卵巢組織。開放式載體雖然保證了冷凍速率，但是直接與液氮接觸可能會(huì)造成病原體傳播，因此限制了其在臨床中的應(yīng)用。

在玻璃化冷凍中，卵巢組織與液氮直接接觸后形成的沸騰氮?dú)獍@在組織周圍，其低導(dǎo)熱性降低了冷凍速率，從而影響冷凍效果[13]，本研究采用的自研載體Ⅰ為80目304不銹鋼金屬篩網(wǎng)，自研載體Ⅱ?yàn)镻ET塑料超薄載體片，可有效改善這一不足，大大提高了冷凍速率。本研究顯示各冷凍組原始卵泡形態(tài)正常率無差異，但是程序化冷凍組初級(jí)卵泡形態(tài)正常率低于新鮮組，而采用自研載體的玻璃化冷凍組的初級(jí)卵泡正常形態(tài)率與新鮮組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Zhou等[14]研究顯示，玻璃化冷凍和程序化冷凍對(duì)于原始卵泡的保存效果相當(dāng)，與本研究HE染色結(jié)果一致。Shi等[15]對(duì)程序化冷凍和玻璃化冷凍效果進(jìn)行了薈萃分析，結(jié)果顯示兩種方法之間原始的保存效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是玻璃化冷凍方法對(duì)DNA損傷較輕，且對(duì)基質(zhì)的保存效果更好。本研究對(duì)各組卵巢組織的凋亡檢測(cè)提示，采用自研載體的玻璃化冷凍組卵巢組織細(xì)胞凋亡率低于程序化冷凍組。這可能是由于卵巢組織中細(xì)胞類型多樣，包括顆粒細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，不同細(xì)胞類型具有不同冰晶點(diǎn)。程序化所采用的冷凍載體系統(tǒng)是冷凍管，將組織置于低濃度冷凍保護(hù)劑中，在逐步降溫過程中使細(xì)胞內(nèi)逐漸脫水，冷凍保護(hù)劑濃度逐漸增加，以防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，它的缺點(diǎn)是打破了細(xì)胞內(nèi)外的平衡狀態(tài)，在復(fù)溫時(shí)易出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)液重結(jié)晶。玻璃化冷凍采用較高濃度的冷凍保護(hù)劑和非?？斓睦鋬鏊俾剩瑥亩鴾p少了細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，防止組織損傷。Fabbri等[16]和Zhao等[8]的研究顯示采用玻璃化冷凍后對(duì)卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞的保存效果優(yōu)于程序化冷凍。

本研究顯示4組卵巢組織體外培養(yǎng)后雌二醇濃度不斷升高，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明冷凍復(fù)蘇過程對(duì)卵巢組織的內(nèi)分泌功能無影響。但是由于卵巢基質(zhì)細(xì)胞也可產(chǎn)生部分激素，所以激素的測(cè)定僅能證明冷凍復(fù)蘇后的卵巢組織仍有活性[17]。PCNA是細(xì)胞生長(zhǎng)周期中重要的調(diào)節(jié)因子，標(biāo)志著卵泡生長(zhǎng)的開始，是檢測(cè)卵泡增殖活性的靈敏指標(biāo)。研究顯示PCNA陽性率新鮮組高于各冷凍組，自研載體玻璃化冷凍組高于程序化冷凍組，但各組之間PCNA陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明冷凍復(fù)蘇過程并不影響細(xì)胞的增殖活性。

綜上，兩種方法均可以較好保存卵巢的結(jié)構(gòu)及其活性，采用自研載體玻璃化冷凍能更好地保存相對(duì)復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，且本研究采用的自研載體系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，有望成為用于人卵巢組織冷凍的良好載體。雖然羊卵巢與人卵巢相似，但二者卵巢大小、排卵周期及卵泡密度等仍存在一定差異。因此，自研載體應(yīng)用于人卵巢組織的玻璃化冷凍效果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。