楊 悅，楊 磊 ，吳 昱 ，袁 軍

1武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院 武漢市第一醫(yī)院麻醉科，武漢 430022 2華中科技大學同濟醫(yī)學院協(xié)和醫(yī)院麻醉科，武漢 430022

七氟醚無刺激性且對血液動力學影響較小，是目前臨床上廣泛使用的嬰幼兒吸入性麻醉藥[1- 2]。但目前有動物實驗表明，七氟醚的吸入會導致新生動物神經(jīng)元凋亡、認知障礙等情況出現(xiàn)[3- 4]。因此，接受七氟醚麻醉后可能會對新生兒神經(jīng)系統(tǒng)的結構以及功能造成損傷。探究降低七氟醚麻醉后對大腦認知功能的影響的具體機制，對降低七氟醚不良反應具有非常重要的作用。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種有效的α2受體激動劑，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗焦慮等作用[5]。目前Dex常用于重癥監(jiān)護室中作為全身麻醉的輔助藥物，從而減少麻醉劑量，并發(fā)揮鎮(zhèn)痛與鎮(zhèn)靜的效果[6- 7]。但目前Dex對大腦認知功能障礙的改善機制尚未完全明確。Wnt信號通路是經(jīng)典的信號通路之一，其分為經(jīng)典Wnt信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路[8]。Wnt信號通路對機體的正常發(fā)育具有非常關鍵的作用。目前多項研究表明，Wnt信號通路對海馬可塑性以及記憶功能具有重要的調(diào)控作用[8- 11]。有研究表明七氟醚可通過有效抑制Wnt信號通路成員的表達，進而促進海馬細胞凋亡[12]。前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)Dex處理大鼠后，Wnt信號通路成員β-鏈蛋白表達發(fā)生了明顯的變化，因此推測Dex可能會通過影響Wnt信號通路的表達，進而影響大腦認知功能。本研究對新生SD雄性幼鼠進行七氟醚處理，構建新生大鼠認知功能障礙模型，并通過一系列處理，探究Dex對七氟醚誘導的新生大鼠認知功能障礙的影響機制。

材料和方法

實驗動物飼養(yǎng)及模型制備60只出生7 d SD雄性幼鼠，約15g，購于斯萊克景達動物公司。置于恒溫恒濕環(huán)境中，分籠飼養(yǎng)，標準飼料無菌水飼養(yǎng)1周適應環(huán)境。動物應用隨機數(shù)字法分為5組，每組12只：正常對照組、七氟醚處理組、Dex處理組、七氟醚+Dex處理組、七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組。

模型制備：Dex處理組、七氟醚+Dex處理組腹腔注射25 μg/kg的Dex，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組腹腔注射25 μg/kg的Dex及2 kg/ml的Wnt抑制劑XAV393 100 μl，其余組注射等體積的生理鹽水。30 min后將大鼠放入封閉的塑料箱內(nèi)，七氟醚處理組、七氟醚+Dex處理組、七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組吸入3%的七氟醚加21%的O2(2 L/min)持續(xù)4 h。Dex處理組和正常對照組暴露在新鮮的空氣下同樣時間，實驗結束后所有大鼠放回籠子常規(guī)飼養(yǎng)。

行為學實驗結束后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)，每組取6只，4%多聚甲醛進行心臟灌注，取大腦組織，甲醛固定，用于組織切片。其余6只斷頭處死大鼠，取海馬組織，凍于液氮中，用于后續(xù)實驗[13]。

熒光定量PCR 檢測相關基因表達凍存的海馬組織從液氮取出，磨成粉末狀，再加入1 ml Trizol(貨號：15596026；Invitrogen；USA)，按照說明書指示提取總RNA，隨后測定儀測濃度。以2 μg RNA為模板進行反轉錄(TaKaRa，Japan)，按說明逆轉錄得到cDNA。采用SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，Japan)于ABI7500定量PCR儀(Thermo，USA)上進行熒光定量PCR實驗，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個PCR循環(huán)。測定擴增條帶的吸光度值，并用其與GAPDH吸光度的比值表示產(chǎn)物mRNA的相對含量。反應中所用的引物如表1所示，引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。

蛋白質(zhì)免疫印跡檢測相關蛋白表達凍存的海馬組織從液氮取出，稱重后加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液的環(huán)氧樹脂管內(nèi)，用電動研磨棒磨成勻漿，離心取上清，重辛酸測蛋白濃度。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(80 V 30 mim，120 V 60 min)，電泳完成后轉移到聚偏二氟乙烯膜(Merck Millipore，USA)上，5%封閉液室溫封閉2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate Tween buffer solution，PBST)洗滌后，加入一抗：Wnt3a 兔單抗(1∶1000；ab219412，Abcam；UK)、β-鏈蛋白兔多抗(1∶2000；ab6302Abcam；UK)、P(ser9)-GSK- 3β兔多抗(1∶500；ab131097；Abcam；UK)、GSK- 3β鼠單抗(1∶500；ab93926；Abcam；UK)、Cleaved 半胱氨酸蛋白酶- 3兔多抗(1∶1000；9664；CST；USA)，Bax兔單抗(1∶1000；14796；CST；USA)，Bcl- 2鼠單抗(1∶2000；964495；Abcam；UK)，GAPDH兔單克隆抗體(1∶10 000；ab181602；Abcam；UK)，4 ℃孵育過夜后，PBST[含0.1% Tween- 20的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)]緩沖液洗膜3次，每次15 min。隨后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠(1∶10 000，Jackson，USA)室溫孵育1 h，PBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。將膜浸入電化學發(fā)光反應液(美國Pierce公司)中，室溫1 min。機器顯影。利用ImageJ軟件進行蛋白條帶灰度掃描，各實驗組與內(nèi)參相比后進行統(tǒng)計分析。

神經(jīng)核免疫組織化學染色4%甲醛中固定，酒精脫水后石蠟包埋(5 μm)，確定海馬組織位置后采取冠狀位連續(xù)切片，進行神經(jīng)核(neuronal nuclei，NeuN)染色：脫蠟、水化及抗原修復后，3%過氧化氫室溫孵育30 min，血清封閉30 min，加入小鼠抗NeuN(1∶100，Millipore，USA)，37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，生物素化羊抗鼠IgG孵育1 h，PBS洗滌3次辣根過氧化物酶標記的親和卵白素孵育1 h(Jackson，USA)，PBS洗滌3次，二氨基聯(lián)苯胺顯色，光鏡觀察，在500 μm×300 μm區(qū)域統(tǒng)計各組海馬組織NeuN陽性細胞數(shù)。

TdT介導的dUTP缺口末端標記實驗染色按照TdT介導的dUTP缺口末端標記實驗(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測試劑盒(C1088，碧云天)說明，取大腦組織切片，60 ℃烘烤2 h，經(jīng)二甲苯、無水乙醇梯度浸泡脫蠟和水化。3%過氧化氫室溫孵育10 min。加入免疫染色液稀釋后的蛋白酶K，37 ℃消化30 min，PBS洗3次。在樣品上加50 μl TUNEL檢測液(TdT酶5 μl 、熒光標記液45 μl、TUNEL染色液50 μl)，37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次?？篃晒獯銣绶馄悍馄鬅晒怙@微鏡下觀察。每只鼠取3個切片，每個切片隨機取6個視野，平均法統(tǒng)計凋亡細胞，計算公式如下：細胞死亡率=死亡神經(jīng)元細胞總數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

表1 熒光定量PCR引物序列

認知功能檢測(Morris水迷宮實驗)模型建立3周后進行Morris水迷宮訓練。水溫恒定實驗前將大鼠放入無平臺水池自由游泳3 mim適應環(huán)境。水池劃分為4個象限，在第4象限放置一直徑為12 cm的逃生平臺。定位航行實驗：每天上午、下午各1次，連續(xù)6 d。隨機選取一象限為起始點，將大鼠面向池壁放入水池中，記錄大鼠到達平臺的時間(逃避潛伏期)。第7天撤去平臺，進入空間探索實驗，記錄大鼠在90 s內(nèi)穿越原始平臺的次數(shù)。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析(one way ANOVE)，聯(lián)合兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

Dex對七氟醚誘導的新生大鼠認知障礙的影響各組大鼠水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期顯示，隨著訓練時間的延長，各組大鼠逃避潛伏期的時間逐漸縮短。第6天實驗結果顯示，與正常對照組相比，Dex處理組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.304，P=0.768)；七氟醚處理組(t=5.823，P=0.002)、七氟醚+Dex處理組(t=3.188，P=0.010)及七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組(t=5.784，P=0.002)逃避潛伏期時間延長，差異有統(tǒng)計學意義。與七氟醚處理組相比，七氟醚+Dex處理組逃避潛伏期時間減少，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.646，P=0.005)。與七氟醚+Dex處理組相比，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組逃避潛伏期時間增長，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.296,P=0.008)。各組穿越平臺次數(shù)結果顯示，與正常對照組比較，七氟醚處理組(t=5.179，P=0.004)、七氟醚+Dex處理組(t=2.309，P=0.043)及七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組(t=3.871，P=0.003)穿越平臺次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義；與七氟醚處理組比較，七氟醚+Dex處理組穿越平臺次數(shù)增加(t=3.296，P=0.008)；與七氟醚+Dex處理組比較，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組穿越平臺次數(shù)較少(t=2.361，P=0.041)(表2)。

Dex對七氟醚誘導的新生大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL染色陽性細胞表達的影響TUNEL染色結果顯示，與正常對照組相比，Dex處理組凋亡細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(t=1.920，P=0.127)，七氟醚處理組、七氟醚+Dex處理組及七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組凋亡細胞數(shù)均有不同程度增加，其中七氟醚處理組增加16%(t=13.436，P=0.002)，七氟醚+Dex處理組增加5%(t=7.752，P=0.001)，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組增加11.5%(t=12.612，P=0.002)。與七氟醚處理組相比，七氟醚+Dex處理組細胞凋亡數(shù)降低11%(t=8.521，P=0.002)，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組降低5.5%(t=3.123，P=0.036)。與七氟醚+Dex處理組相比，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組細胞凋亡增加6.5%(t=6.250，P=0.003)(圖1)。

TUNEL：dUTP缺口末端標記；與正常對照組比較，a P<0.05；與七氟醚處理組比較，b P<0.05；與七氟醚+Dex處理組比較，c P<0.05

Dex對七氟醚誘導的新生大鼠海馬CA1區(qū)NeuN染色陽性細胞表達的影響NeuN染色結果顯示，在0.15 mm2區(qū)域內(nèi)，與正常對照組相比，Dex處理組(t=0.898，P=0.136)及七氟醚+Dex處理組(t=0.203，P=1.519)陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，七氟醚處理組及七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組陽性細胞數(shù)均有不同程度減少，其中七氟醚處理組、七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組陽性細胞數(shù)分別減少31(t=4.702，P=0.009)及26個(t=3.948，P=0.014)。與七氟醚處理組相比，七氟醚+Dex處理組陽性細胞數(shù)增加17個(t=3.415，P=0.018)，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組增加5個(P=0.001)。與七氟醚+Dex處理組比較，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組陽性細胞減少12個(t=3.010，P=0.039)(圖2)。

海馬神經(jīng)元細胞凋亡相關蛋白半胱氨酸蛋白酶3、Bax、Bcl- 2的表達蛋白質(zhì)免疫印跡檢測海馬組織中凋亡相關蛋白半胱氨酸蛋白酶3、Bax、Bcl- 2的灰度值，結果顯示與正常對照組比較，Dex處理組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.612，P=0.573；t=1.225，P=0.288；t=0.961，P=0.391)，七氟醚處理組、七氟醚+Dex處理組及七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組Bax(t=13.440，P=0.002；t=8.520，P=0.001；t=13.320，P=0.002)及半胱氨酸蛋白酶3(t=9.860，P=0.001；t=6.120，P=0.004；t=11.620，P=0.003)均表達上調(diào)，Bcl- 2(t=7.671，P=0.002；t=2.880，P=0.045；t=6.280，P=0.003)表達下調(diào)。與七氟醚處理組相比，七氟醚+Dex處理組Bax(t=8.130，P=0.001)及半胱氨酸蛋白酶3(t=7.120，P=0.002)均表達下調(diào)，Bcl- 2(t=6.201，P=0.003)表達上調(diào)。與七氟醚+Dex處理組相比，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組Bax(t=7.310，P=0.002)及半胱氨酸蛋白酶3(t=7.750，P=0.002)均表達上調(diào)，Bcl- 2(t=4.206，P=0.013)表達下調(diào)(圖3)。

NeuN：神經(jīng)元核抗原；與正常對照組比較，a P<0.05；與七氟醚處理組比較，b P<0.05；與七氟醚+Dex處理組比較，c P<0.05

Wnt/β-鏈蛋白通路相關因子Wnt3a、GSK- 3β、β-鏈蛋白的mRNA表達熒光定量PCR檢測海馬組織Wnt/β-鏈蛋白信號通路相關分子Wnt3a、GSK- 3β、β-鏈蛋白mRNA的表達情況，結果顯示與正常對照組相比，Dex處理組Wnt3a、GSK- 3β及β-鏈蛋白(t=1.230，P=0.290；t=0.901，P=0.418；t=1.837，P=0.140)及七氟醚+Dex處理組Wnt3a、β-鏈蛋白(t=1.102，P=0.332；t=1.030，P=0.361)表達差異均無統(tǒng)計學意義，七氟醚處理組(t=5.790，P=0.004；t=7.130，P=0.002)、七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組(t=7.130，P=0.002；t=5.500，P=0.005)中Wnt3a、β-鏈蛋白均表達下調(diào)，七氟醚處理組(t=4.800，P=0.009)、七氟醚+Dex處理組(t=2.940，P=0.045)及七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組(t=3.100，P=0.042)GSK- 3β表達上調(diào)。與七氟醚處理組相比，七氟醚+Dex處理組Wnt3a(t=4.460，P=0.011)及β-鏈蛋白(t=6.390，P=0.003)均表達上調(diào)，GSK- 3β(t=4.160，P=0.004)表達下調(diào)。與七氟醚+Dex處理組相比，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組Wnt3a(t=5.730,P=0.005)及β-鏈蛋白(t=4.640，P=0.010)均表達下調(diào)，GSK- 3β有表達上調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(t=3.240，P=0.117)(圖4)。

與正常對照組比較，a P<0.05；與七氟醚處理組比較，b P<0.05；與七氟醚+Dex處理組比較，c P<0.05

與正常對照組比較，a P<0.05；與七氟醚處理組比較，b P<0.05；與七氟醚+Dex處理組比較，c P<0.05

Wnt/β-鏈蛋白通路相關因子Wnt3a、GSK- 3β、β-鏈蛋白的蛋白表達蛋白質(zhì)免疫印跡檢測海馬組織中Wnt/β-鏈蛋白信號通路相關分子Wnt3a、P(ser9)-GSK- 3β/GSK- 3β及β-鏈蛋白蛋白灰度值情況，結果顯示與正常對照組相比，Dex處理組(t=0.735，P=0.503；t=0.245，P=0.819)及七氟醚+Dex處理組(t=1.623，P=0.180；t=1.159，P=0.311)Wnt3a、β-鏈蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，七氟醚處理組(t=7.280，P=0.002；t=5.640，P=0.005)與七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組(t=7.240，P=0.002；t=4.970，P=0.008)表達下調(diào)。與七氟醚處理組相比，七氟醚+Dex處理組Wnt3a(t=6.410，P=0.003)、β-鏈蛋白表達上調(diào)(t=4.640，P=0.015)。與七氟醚+Dex處理組相比，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組Wnt3a(t=6.360，P=0.003)、β-鏈蛋白表達下調(diào)(t=4.640，P=0.016)。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測P(ser9)-GSK- 3β/GSK- 3β蛋白灰度值，結果顯示與正常對照組相比，七氟醚處理組(t=11.280，P=0.002)、七氟醚+Dex處理組(t=7.080，P=0.002)及七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組(t=9.970，P=0.001)P(ser9)-GSK- 3β/GSK- 3β均表達下調(diào)。與七氟醚處理組相比，七氟醚+Dex處理組P(ser9)-GSK- 3β/GSK- 3β表達上調(diào)(t=8.310，P<0.001)。與七氟醚+Dex處理組相比，七氟醚+Dex處理+Wnt抑制劑組P(ser9)-GSK- 3β/GSK- 3β表達下調(diào)(t=5.510，P=0.005)(圖5)。

與正常對照組比較，a P<0.05；與七氟醚處理組比較，b P<0.05；與七氟醚+Dex處理組比較，c P<0.05

討 論

越來越多的研究表明七氟醚麻醉會造成新生大鼠神經(jīng)細胞凋亡以及認知功能障礙[14- 15]。這意味著使用七氟醚麻醉對新生兒具有神經(jīng)毒性，會對新生兒大腦認知功能造成影響。

Dex常用于全身麻醉的輔助劑，由于其具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛的效果，目前Dex在兒科醫(yī)學上的應用越來越多[16]。有研究表明Dex可通過誘導自然睡眠，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜效果[17]。研究表明，Dex的輔助用藥可改善新生大鼠認知功能障礙[18]。更有研究表明Dex可減輕七氟醚誘導的新生大鼠神經(jīng)退行性病變和長期記憶障礙[19]。本研究證實七氟醚處理后會導致大鼠神經(jīng)元凋亡和認知功能障礙。而Dex可抑制七氟醚處理后大鼠神經(jīng)元凋亡，促進神經(jīng)元存活，并改善大鼠認知功能障礙。

前期研究顯示經(jīng)Dex處理后的大鼠，Wnt信號通路成員β-鏈蛋白表達發(fā)生明顯改變，因此筆者推測Dex對大鼠認知功能的改善作用可能通過作用于Wnt信號通路實現(xiàn)。Wnt信號通路對機體發(fā)育必不可少，Wnt信號通路對心臟發(fā)育、骨骼疾病、癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育均具有關鍵的調(diào)控作用[19- 21]。在神經(jīng)發(fā)育的調(diào)控中，Wnt信號通路是大腦中海馬神經(jīng)元的形成和可塑性所必需的。且Wnt信號通路可促進海馬學習和記憶[22]。七氟醚麻醉后，會導致Wnt信號通路被抑制，進而產(chǎn)生認知功能障礙[23]。Wnt信號通路成員主要包括Wnt3a、GSK- 3β、β-鏈蛋白等[24- 25]。Wnt3a可特異性調(diào)控海馬神經(jīng)元的增殖。GSK- 3β磷酸化被激活后或β-鏈蛋白表達升高后，可促進記憶鞏固，增強海馬學習能力[26- 28]。七氟醚可通過抑制Wnt/β-鏈蛋白活性，抑制其轉錄水平，進而抑制細胞的增殖[29]。七氟醚對Wnt3a、GSK 3β和β-鏈蛋白的表達有影響，七氟醚可抑制Wnt/β-鏈蛋白的活性[30]。本研究證實Wnt信號通路被抑制后，神經(jīng)元凋亡升高，存活率降低，認知功能障礙加重。七氟醚處理后大鼠Wnt信號通路表達被抑制，且進一步研究證實Dex處理后，促進Wnt信號的傳導，進而改善新生大鼠認知功能。因此，筆者推測Dex通過促進Wnt信號通路活性，促進信號通路下游基因的轉錄調(diào)控，進而改善七氟醚誘導的新生大鼠認知功能障礙。

綜上，筆者探究Dex對七氟醚處理后新生大鼠認知障礙的影響，完善Dex對新生大鼠認知功能障礙的信號傳導機制。而β-鏈蛋白的過度表達則會導致神經(jīng)前體細胞的增殖，進而導致神經(jīng)細胞過度增殖。因此，Dex可能會存在未知的不良反應，導致機體毒性的積累，但目前對這一問題尚未進行深入探究。筆者發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路抑制劑處理后，未能完全阻斷Dex對新生大鼠認知功能障礙的改善作用，因此推斷Dex可通過多種途徑改善新生大鼠認知功能障礙，仍需進一步探究并完善Dex對新生大鼠認知功能障礙的作用機制。