周凱，蘇琪盛，黎承楊

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，廣西 南寧 530021)

0 引言

腎透明細(xì)胞癌是成年人最常見(jiàn)的一種腎臟腫瘤，是來(lái)源于腎臟泌尿小管上皮系統(tǒng)的一種惡性腫瘤，大概占到所有腎腫瘤的大約75%[1]。目前有大量研究表明，microRNA(miRNA)在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[2-4]。

miR-506-3p腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)，其低表達(dá)與晚期臨床分期和預(yù)后不良有關(guān)，并通過(guò)直接靶向腎癌中的FLOT1發(fā)揮其抗癌功能[5]，然而miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌中的作用仍有待進(jìn)一步探究。本文采用生物信息學(xué)手段，對(duì)miR-506-3p 在腎透明細(xì)胞癌中的作用進(jìn)行探究，以期為后期深入研究miR-506-3p 在腎透明細(xì)胞癌中的作用及其機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 Starbase工具分析miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌表達(dá)

Starbase v3.0是一款由Qu Lab. School of Life Science，Sun Yat-sen University開(kāi)發(fā)的一個(gè)開(kāi)源平臺(tái)，可以分析CLIP-seq、ome-seq和RNA-RNA間質(zhì)數(shù)據(jù)研究miRNAncRNA、miRNA-mRNA、ncRNA-RNA、RBP-ncRNA和RBPmRNA相互作用[6]。我們通過(guò)starbase中的starBase Pan-Cancer Analysis Platform平臺(tái)工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中hasmiR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)。

1.2 GEO2R分析腎透明細(xì)胞癌中上調(diào)的差異基因

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GEO Dataset目錄下，檢索2013年1月1日至今，人類(lèi)腎透明細(xì)胞癌組織及對(duì)照組織表達(dá)的數(shù)據(jù)集，設(shè)置檢索式為(("kidney"[MeSH Terms]OR Kidney[All Fields]) AND ("carcinoma，renal cell"[MeSH Terms]OR Renal Clear Cell Carcinoma[All Fields])) AND "Homo sapiens"[porgn]AND ("gse"[Filter]AND "Expression profiling by array"[Filter]AND "attribute name tissue"[Filter]AND ("2013/01/01"[PDAT]："2018/09/25"[P-DAT]))，結(jié)果再篩選能夠獲取注釋文件及平臺(tái)信息的數(shù)據(jù)集，納入GSE40435、[7]GSE53757、[8]GSE68417[9]三個(gè)數(shù)據(jù)集，使用GEO2R網(wǎng)絡(luò)在線(xiàn)工具對(duì)獲取的數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異基因分析，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將上調(diào)的差異基因用Venny 2.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.e-s/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖。

1.3 靶基因的預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因的查找

miRDIP數(shù)據(jù)庫(kù)[10]預(yù)測(cè)Minimum Score為very high且來(lái)源數(shù)據(jù)庫(kù)大于15個(gè)的靶基因。通過(guò)mirtarbase[11](更新于Sept. 15，2017)查找實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因，同時(shí)查閱文獻(xiàn)尋找2017年9月15日后發(fā)表文獻(xiàn)中涉及到的miR-506-3p靶基因，以上三者的并集被納入作為靶基因集合，將差異基因與靶基因集合取交集作為候選靶基因進(jìn)行下一步分析。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將上述的到的候選靶基因?qū)雗etworkanalyst[12](http：//www.networkan-alyst.ca/face-s/home.xhtml)構(gòu)建miR-506-3p靶基因編碼蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌表達(dá)

starbase中的starBase Pan-Cancer Analysis Platform中，來(lái)自TCGA的miRNA seq表達(dá)數(shù)據(jù)通過(guò)log2(RPM + 0.01)表示并繪得箱型圖(圖1)，miR-506-3p在正常樣本中(71例)的表達(dá)高于腎透明細(xì)胞癌樣本(517例)(P=1.6×10-61)。

圖1 miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌表達(dá)下調(diào)

2.2 GEO2R獲取上調(diào)的透明細(xì)胞癌差異基因

經(jīng)過(guò)GEO2R工具，GSE40435篩得17892個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因7363個(gè)下調(diào)基因10529個(gè)、GSE53757篩得28021個(gè)差異表達(dá)基因其中上調(diào)基因7855個(gè)，下調(diào)基因20166個(gè)、GSE68417篩得10157個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因4892個(gè)，下調(diào)基因5265個(gè)。三個(gè)數(shù)據(jù)集曬出的上調(diào)差異基因取交集共得到2975個(gè)在三者均為上調(diào)的差異基因。

2.3 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因

miRDIP預(yù)測(cè)到靶基因共計(jì)Minimum Score為very high、來(lái)源數(shù)據(jù)庫(kù)大于等于15個(gè)的靶基因共計(jì) 431個(gè)，Mirtarbase數(shù)據(jù)庫(kù)查找到FXN、SNAI2、CD151、VIM、CDK4、CDK6六個(gè)基因?yàn)閾碛袕?qiáng)證據(jù)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、westen blot、qPCR)支持的靶基因。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，F(xiàn)LOT1、[5]IL8、[13]NEK6、[14]JAG1、[15]RAB3D、[16]STAT3、[17]BECN1、[18]CREB1、[19]KLF4、[20]KLF5[20]亦被納入作為候選靶基因。以上三者的并集共計(jì)442個(gè)基因作為靶基因集合(圖3.左)，與差異上調(diào)基因取交集得到116個(gè)候選靶基因(圖3.右)。

圖2 三個(gè)數(shù)據(jù)集上調(diào)差異基因的交集

圖3 靶基因交集（左）和候選靶基因（右）

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

Networkanalyst繪制的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，圖中顯示hasmiR-506-3p的靶基因編碼的蛋白間有著復(fù)雜的互相作用關(guān)系(圖4)，互作數(shù)量排名前十的基因?yàn)椋篣BC、SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ELAVL1、ETS1、BCL6、IQGAP1、APP。其 中SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1七個(gè)基因?yàn)榍拔牡玫降膆sa-miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌中作用的候選靶基因。

3 討論

MicroRNA (miRNA) 是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)谡婧嘶蜣D(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。miRNA參與到了幾乎所有生物過(guò)程中，異常的miRNA表達(dá)通常與癌癥有關(guān)。自2002年，Calin等發(fā)現(xiàn)miR-15 and miR-16在慢性淋巴細(xì)胞白血病中頻繁缺失和下調(diào)以來(lái)[21]，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中扮演十分重要的角色。

miR-506-3p在多種腫瘤中下調(diào)，作為一種抑癌基因被研究，并通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)基因在腫瘤中發(fā)揮作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p。在某些情況下miR-506-3p亦可在腫瘤中發(fā)揮不同的作用，如黑色素瘤中其作為癌基因存在[22]，在羥基喜樹(shù)堿(HCPT)抗性人結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)等[23]。

本文通過(guò)生物信息學(xué)的手段，對(duì)miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌中的作用進(jìn)行了初步的探究，starBase Pan-Cancer Analysis Platform的結(jié)果顯示，miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌中較正常組織低下調(diào)，這與現(xiàn)有關(guān)于miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌中的研究相同，故本文認(rèn)為其在腎透明細(xì)胞癌中下調(diào)是可信的。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

本文研究得到SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1七個(gè)可能的miR-506-3p在腎透明細(xì)胞癌的中發(fā)揮作用的靶基因。此七個(gè)基因在腫瘤中的發(fā)生發(fā)展均得到了廣泛研究，除IQGAP1外，其余基因在腎透明細(xì)胞癌中的作用都有報(bào)道[19,24-27]。值得一提的是，有文獻(xiàn)報(bào)道SP1在pVHL抑制轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用[28]。本次研究發(fā)現(xiàn)miR-506-3p有可能通過(guò)作用于SP1、CREB1、VIM、NR3C1、ETS1、BCL6、IQGAP1從而參與到腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中。但由于缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，本研究的結(jié)論仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證以探索其在腎透明細(xì)胞癌中的機(jī)制，以及其在診斷和分子治療中的應(yīng)用。