謝志敏 沈旭成 戴向農(nóng) 李青青 葉興東

1廣州市皮膚病防治所皮膚科，廣州，510095；2廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所皮膚科，廣州，510095

尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris, PV)是一種慢性自身免疫性大皰性皮膚病。其發(fā)病機(jī)制為患者血循環(huán)中產(chǎn)生針對皮膚結(jié)構(gòu)蛋白中的橋粒芯糖蛋白(desmoglein，Dsg)1和Dsg3的自身抗體，當(dāng)自身抗體與抗原結(jié)合時，發(fā)生細(xì)胞連級反應(yīng)，引起橋粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附喪失和表皮內(nèi)水皰形成。然而，通過直接或間接免疫熒光檢測到抗角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)抗體的PV患者中，有10%～15%的患者抗Dsg1/3 ELISA檢測為陰性[1]。將抗Dsg1/3自身抗體檢測陰性的PV患者血清注射新生小鼠后也會出現(xiàn)棘層松解及水皰形成[2]。所以單憑Dsg1和Dsg3自身抗體不足以完全解釋天皰瘡中細(xì)胞間黏附喪失的機(jī)制。

在PV患者中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多針對橋粒其他結(jié)構(gòu)和代謝蛋白的非Dsg自身抗體，如橋粒膠蛋白(desmocollin，Dsc)1和Dsc3、乙酰膽堿受體、線粒體蛋白、甲狀腺過氧化物酶、分泌途徑Ca2+/Mn2+-ATP酶亞型1(secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase isoform 1，SPCA1)、斑菲素蛋白(plakophilin，PKP)1和PKP3、斑珠蛋白(plakoglobin，PG)及橋粒斑蛋白(desmoplakin，DP)等。研究表明，這些非Dsg自身抗體在天皰瘡發(fā)病的復(fù)雜過程中協(xié)同補(bǔ)充了抗Dsg自身抗體的經(jīng)典作用。

本文旨在探討非Dsg蛋白在PV發(fā)病機(jī)制中的作用以及其在PV的檢測、靶向治療中的重要意義。

1 橋粒膠蛋白(desmocollin, Dsc)

Dsc屬于鈣黏蛋白家族，是橋粒的重要組成部分，在細(xì)胞間黏附中起重要作用。Dsc3主要表達(dá)于基底層與基底上層，Dsc2在表皮基底層的表達(dá)較低，Dsc1主要表達(dá)于表皮上層，后者已被證實(shí)是IgA天皰瘡的自身抗原[3]?？笵sc3特異性抗體已被證實(shí)有致病性[4]，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗Dsc3抗體會導(dǎo)致KC的黏附喪失[5]?？笵sc抗體在副腫瘤性天皰瘡、皰疹樣天皰瘡和增殖型天皰瘡患者中可被檢出[6]。部分PV患者及非典型臨床表現(xiàn)的PV患者中也發(fā)現(xiàn)了抗Dsc1、Dsc2和Dsc3抗體[7,8]。Lotti等[9]發(fā)現(xiàn)，注射Dsc3自身反應(yīng)性脾細(xì)胞的Rag2基因缺失小鼠的鼻和面頰周圍出現(xiàn)了紅斑、糜爛、結(jié)痂及斑片狀的毛發(fā)脫落。

近年來的研究表明，Dsg與Dsc之間的異質(zhì)結(jié)合是橋粒連接的基本結(jié)構(gòu)，Dsc和Dsg通過細(xì)胞最外層N末端的同質(zhì)及異質(zhì)性相互作用，介導(dǎo)相鄰細(xì)胞中間絲之間的連接[10]。Ishii等[10]通過體外實(shí)驗(yàn)重組Dsg與Dsc的胞外域，發(fā)現(xiàn)抗Dsg抗體、PF-IgG及PV-IgG可以阻斷Dsg與Dsc的結(jié)合。

Mindorf等[11]對126例有口腔病變的PV患者進(jìn)行Dsc1、Dsc2、Dsc3抗體檢測，僅有一例Dsg3陰性的患者檢測出抗Dsc3-IgG抗體陽性。因此有學(xué)者認(rèn)為抗Dsc抗體并非適合PV患者的常規(guī)檢測，對于非典型臨床表現(xiàn)或抗Dsg1/3抗體檢測陰性的患者可以考慮進(jìn)行抗Dsc抗體檢測。

2 斑菲素蛋白(plakophilin，PKP)

PKP是橋粒黏附至關(guān)重要的蛋白，參與調(diào)節(jié)橋粒內(nèi)鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與其他橋粒間蛋白相互作用，促進(jìn)橋粒鈣黏蛋白與DP和角蛋白中間絲網(wǎng)絡(luò)的連接。原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)顯示缺乏PKP1及PKP3的KC在細(xì)胞邊界處發(fā)現(xiàn)Dsg1和Dsg3的膜利用率和結(jié)合頻率下降，而PKP1是Dsg3聚集所必須的[12]。

PKP3參與了DP簇團(tuán)向膜的轉(zhuǎn)移，并以Ras相關(guān)蛋白1(Ras-related protein 1,Rap1)依賴的方式穩(wěn)定橋粒鈣黏蛋白[13]。Cirillo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PV-IgG與KC結(jié)合30 min后PKP3以Src依賴方式被酪氨酸磷酸化，隨后與Dsg3分離，最終部分被消耗，磷酸化的PKP3可能作為信號分子參與細(xì)胞的分離。PKP1的過表達(dá)可以增加橋粒長度，穩(wěn)定并增強(qiáng)橋粒黏附，防止Dsg3和其他橋粒蛋白從細(xì)胞邊緣丟失，并可預(yù)防PV-IgG處理的KC連接體超微結(jié)構(gòu)的改變[15]。

3 斑珠蛋白(plakoglobin，PG)、橋粒斑蛋白(desmoplakin，DP)

PG和DP是橋粒內(nèi)的接合蛋白，它們作為跨膜黏附分子起到固定中間絲細(xì)胞骨架的作用。PV自身抗體導(dǎo)致PG的聚集及耗竭，PG的缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)聚力的喪失和p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的活化及角蛋白回縮，PG通過調(diào)控p38MAPK活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)聚[16]。

Thomas等[17]通過短干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)改變DP的水平發(fā)現(xiàn)，DP的耗竭與異常肌動球蛋白網(wǎng)絡(luò)連接和收縮力有關(guān)。DP在與PV-IgG共孵育后以蛋白酶C(protein kinase C，PKC)依賴的方式被磷酸化；而針對DP突變位點(diǎn)S2849G的綠色熒光蛋白載體的表達(dá)可阻止DP磷酸化，增強(qiáng)KC間黏附，改善自身抗體介導(dǎo)的角蛋白絲回縮，并增加PKC-α與活化C激酶1的PKC支架受體的聯(lián)系[18]。除此之外，DP還跟Rac、p38MAPK及Wnt/β-catenin 等信號通路相關(guān)[19，20]。

4 乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)

表皮KC同時表達(dá)煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)和毒蕈堿乙酰膽堿受體，這兩種受體亞型共同起作用以維持細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附。乙酰膽堿主要位于表皮的最下層，起到調(diào)節(jié)KC增殖、遷移以及細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與底物黏附的作用。有85%～100%的PV及PF患者產(chǎn)生抗角質(zhì)形成細(xì)胞AChR抗體[21]。

PV患者血清的抗毒蕈堿乙酰膽堿受體M3亞型(muscarinic acetylcholine receptor subtype M3，M3AR)抗體水平比健康對照組升高[21]。Chernyavsky等[1]在抗Dsg1/3抗體陰性的PV患者中發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白自身抗體與M3AR及SPCA1協(xié)同誘導(dǎo)棘層分解的機(jī)制?？筂3AR抗體增加了p38MAPK及非受體酪氨酸激酶Src的活性[2]。nAChR在細(xì)胞表面及線粒體外膜上表達(dá)。有研究表明，在線粒體外膜上，PV-IgG可以特異性地與幾種線粒體nAChR亞型結(jié)合，說明PV-IgG損害了這些受體的抗凋亡功能；而激活線粒體nAChR可以消除PV-IgG的促凋亡作用，減少細(xì)胞色素C(cytochrome c，Cyt C)釋放，且呈劑量依賴性，提示對線粒體的保護(hù)可能是煙堿類激動劑在天皰瘡中抗凋亡作用的新機(jī)制[22]。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)抗Dsg3及抗AChR抗體與PV疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，抗M3AR抗體滴度隨著治療而下降，M3AR滴度或許可以起到病情監(jiān)測的作用[21，23]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毒蕈堿類及煙堿類拮抗劑增加KC的通透性，導(dǎo)致棘層松解，并擴(kuò)大表皮細(xì)胞間隙；同時膽堿能激動劑能夠逆轉(zhuǎn)棘層松解[24]。提示膽堿能激動劑可能在天皰瘡的治療中起著重要作用。Chernyavsky等[2]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的抗M3AR、抗Dsc3及抗SPCA1自身抗體并不能導(dǎo)致小鼠水皰形成，只是在角質(zhì)形成細(xì)胞上的黏附能力出現(xiàn)不同程度的改變；抗M3AR自身免疫性抗體加強(qiáng)了抗SPCA1自身免疫性抗體的促凋亡作用。提示非Dsg自身抗體同時攻擊不同的自身抗原，單獨(dú)或者協(xié)同誘導(dǎo)激活不同的下游信號通路參與疾病的發(fā)生。

5 分泌途徑Ca2+/Mn2+-ATP酶亞型1(secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase isoform 1，SPCA1)

家族性良性慢性天皰瘡(Hailey-Hailey disease)的患者中發(fā)現(xiàn)ATP2C1發(fā)生了突變，Ca2+-依賴的細(xì)胞內(nèi)信號和細(xì)胞內(nèi)Ca2+/Mn2+穩(wěn)態(tài)的改變，導(dǎo)致表皮細(xì)胞黏附喪失，表現(xiàn)為PV皮膚病變的非免疫表型[25]。而由ATP2C1基因編碼的SPCA1，已經(jīng)在部分PV患者血清中發(fā)現(xiàn)[2]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗SPCA1自身免疫性抗體可導(dǎo)致KC明顯收縮[1]。抗SPCA1抗體增強(qiáng)細(xì)胞凋亡標(biāo)記物細(xì)胞CytC跟半胱天冬酶(Caspase)9的活性，由抗SPCA1 抗體觸發(fā)的促凋亡信號傳導(dǎo)通路以線粒體為靶點(diǎn)[2]。

6 甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)

在天皰瘡患者及其親屬中發(fā)現(xiàn)自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)的發(fā)病率最高，其次為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及1型糖尿病[26]，有學(xué)者認(rèn)為PV跟AITD屬于同一類自身免疫性疾病群[27]。

研究發(fā)現(xiàn)4%～40%的PV患者抗甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)抗體陽性，而抗Dsg1/3抗體陰性患者的陽性率更高[27,28]。缺乏PV相關(guān)人類抗白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)DQB1*0503的抗TPO抗體陽性率高于攜帶的患者，但疾病的嚴(yán)重程度與抗TPO抗體水平無關(guān)[27]?？筎PO抗體影響KC內(nèi)的信號通路，類似于抗Dsg3抗體結(jié)合后的信號通路改變[27]。

7 線粒體蛋白(mitochondrial protein)

線粒體是細(xì)胞能量的主要來源，線粒體功能障礙會導(dǎo)致KC凋亡。研究發(fā)現(xiàn)PV-IgG激活KC中的線粒體凋亡通路，表現(xiàn)為CytC的升高和caspase 9的激活[29]。PV患者產(chǎn)生的抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibodies，AMAs)破壞了電子傳遞鏈，導(dǎo)致內(nèi)膜的電化學(xué)梯度損失，增加了活性氧自由基的產(chǎn)生，降低了KC對應(yīng)激的反應(yīng)能力[30，31]。AMAs與抗Dsg抗體協(xié)同誘導(dǎo)表皮棘細(xì)胞松解，對AMAs的吸附抑制了PV-IgG在體內(nèi)和體外引起的棘層松解[32]。對264例PV患者及138名對照組的蛋白組學(xué)分析提示88%的PV患者至少有一種線粒體蛋白抗體[30]。越來越多的證據(jù)表明，米諾環(huán)素、煙酰胺、環(huán)孢素等保護(hù)線粒體的藥物對PV患者有治療作用。對線粒體功能保護(hù)可能是一種非免疫抑制的新療法。

8 展望

總之，PV患者抗Dsc抗體、抗AChR抗體、抗SPAC1抗體、抗TPO抗體及抗線粒體抗體的滴度與患者病情密切相關(guān)，且治療成功后滴度降低，其中抗AchR抗體與PV患者的相關(guān)性更強(qiáng)，而抗Dsc抗體的特異性更高。另外部分抗Dsg抗體陰性的PV患者發(fā)現(xiàn)上述抗體陽性，對這些抗體的檢測是診斷不典型PV的一種方法。PV的常規(guī)治療中免疫抑制劑可以減少抗體產(chǎn)生，而非免疫抑制劑因其增加細(xì)胞黏附、減少細(xì)胞凋亡，是PV治療的新靶點(diǎn)。PKP、PG及DP等在穩(wěn)定并增強(qiáng)橋粒黏附，固定中間絲細(xì)胞骨架等中有重要作用，線粒體蛋白有助于穩(wěn)定KC細(xì)胞，通過促進(jìn)PKP、PG及DP的表達(dá)以及保護(hù)線粒體功能可能是治療天皰瘡的潛在方法。