曾 君 李時飛 周小芳 汪 婷 宋志強 翟志芳

陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，重慶，400038

SLE是一種病因尚未明確可累及多器官系統(tǒng)的自身免疫性疾病。目前已知機體細胞凋亡加速，凋亡細胞的清除缺陷是其重要的發(fā)病機制之一。近年來研究[1]顯示PS-PLA1通過特異性水解磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)影響凋亡細胞的清除，在SLE發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。本研究通過檢測并比較SLE患者與健康對照組PS-PLA1表達差異，及其與SLE疾病活動的相關(guān)性，旨在探討PS-PLA1在SLE疾病活動評價中的價值，為臨床診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2019年1～12月就診于我院的SLE患者101例，男7例，女94例，平均年齡(37.009±12.527)歲。患者納入標準：①病例診斷明確，SLE診斷參照1997年美國風濕病協(xié)會(ACR)修訂的分類標準[2]，狼瘡腎炎定義參照2019年中國狼瘡腎炎診斷指南[3]。②臨床病歷資料完整?；颊吲懦龢藴剩耗[瘤、妊娠、原發(fā)性肝腎疾病、感染性疾病及其它自身免疫性疾病。收集同期健康體檢者85例，男4例，女81例，平均年齡(38.514±11.378)歲。兩組年齡和性別均無明顯差異。本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2 臨床資料與分組 收集SLE患者臨床資料及實驗室指標：基本信息包括性別、年齡、病程等；臨床表現(xiàn)包括特異性皮疹(包括蝶形紅斑、DLE、SCLE以及ACLE皮損)、黏膜潰瘍、脫發(fā)、光過敏、關(guān)節(jié)痛等；實驗性指標包括血常規(guī)如白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)；尿常規(guī)如血尿、蛋白尿；血生化如血肌酐、血尿酸、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶；補體(C3，C4)及CRP；自身抗體譜如抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗心磷脂抗體、抗核小體抗體、抗組蛋白抗體和抗U1-RNP抗體等。根據(jù)SLEDAI評分對患者疾病活動進行分組[4]：穩(wěn)定組31例(SLEDAI 0～4分)，輕度活動組45例(SLEDAI 5～9分)，中重度活動組25例(SLEDAI ≥10分)；同時以SLEDAI 5～9分為低度活動組(45例)，SLEDAI≥10分為高度活動組(25例)。

1.3 PS-PLA1檢測 收集SLE患者及健康對照組空腹外周靜脈血2 mL，室溫下自然凝固15 min，離心機(德國eppendorf 5810R)離心20 min(2500 r/min)，仔細收集上清。PS-PLA1檢測ELISA試劑盒(江蘇晶美公司)采用雙抗體夾心法按照試劑盒具體操作步驟進行操作，測定各組血清中PS-PLA1水平，用酶標儀(美國BIO-RAD iMark)MPM6.0軟件在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，每個標本設(shè)3個復(fù)孔，結(jié)果取平均值。根據(jù)標準品繪制標準曲線，計算各樣本中PS-PLA1含量。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者臨床資料比較 101例SLE患者，穩(wěn)定組31例，活動組(包括輕、中重活動組)70例。穩(wěn)定期患者臨床表現(xiàn)如特異性皮疹、關(guān)節(jié)痛、黏膜潰瘍、脫發(fā)、光過敏、血尿、蛋白尿的發(fā)生率均顯著低于活動組(均P<0.05)。穩(wěn)定組患者實驗室指標如補體C3、C4顯著高于活動組(P<0.05)；穩(wěn)定組患者血尿酸值、抗dsDNA抗體和抗SM抗體陽性率顯著低于活動組(P<0.05)。兩組間白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)、血肌酐、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗心磷脂抗體、抗核小體抗體、抗組蛋白抗體、抗U1-RNP抗體陽性率均無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.2 血清PS-PLA1的表達 SLE患者血清中PS-PLA1(35.555±10.098)ng/mL明顯高于健康對照組(26.416±9.785)ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.236，P<0.001)。穩(wěn)定組PS-PLA1(29.532±8.194)ng/mL明顯低于活動組(38.222±9.752)ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.328，P<0.001)。穩(wěn)定組PS-PLA1與輕度活動組(34.790±8.854)ng/mL、中重度活動組(44.398±8.238)ng/mL三者間差異有統(tǒng)計學意義(F=21.459，P<0.001)；組間比較均有顯著差異(P值分別為0.009，<0.001，<0.001)。低度活動組PS-PLA1(34.790±8.854)ng/mL明顯低于高度活動組(44.398±8.238)ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.457,P<0.001)，見圖1。

注：*P、**P和***均P<0.001

圖1 SLE患者不同疾病活動性組間PS-PLA1表達差異

本組研究中狼瘡腎炎患者23例，非狼瘡腎炎患者78例。狼瘡腎炎組血清中PS-PLA1表達水平(37.365±11.815)ng/mL高于非狼瘡腎炎組PS-PLA1(35.176±9.430)ng/mL，但差異無統(tǒng)計學意義(t=0.922，P=0.359)。

表1 SLE患者臨床資料和實驗室指標的組間差異比較

2.3 SLE患者PS-PLA1水平與實驗室指標和SLEDAI評分的相關(guān)性 各單因素實驗室指標在SLE穩(wěn)定期與活動期的差異分析顯示，P值<0.05的指標分別為PS-PLA1、血尿酸、C3、C4、CRP、抗dsDNA抗體和抗Sm抗體，將上述變量納入多元線性回歸模型，校正混雜因素后的得出PS-PLA1、C3、CRP是SLE病情活動的獨立相關(guān)因素(表2)。

血清中PS-PLA1水平與C3、C4呈明顯負相關(guān)(r=-0.318，P=0.001；r=-0.204，P=0.041)；與CRP、抗dsDNA抗體和SLEDAI評分呈明顯正相關(guān)(r=0.262，P=0.008；r=0.231，P=0.020；r=0.526，P<0.001)(圖2)；血清中PS-PLA1水平與白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)等無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表2 SLEDAI評分與實驗室指標的多元線性回歸分析

2.4 PS-PLA1與SLE疾病活動相關(guān)性的敏感性與特異性 PS-PLA1預(yù)測SLE疾病活動高低程度的ROC曲線結(jié)果顯示：曲線下面積(AUC)為0.788，SE=0.054，95%CI=0.682～0.894，最佳臨界值為0.467，PS-PLA1水平≥39.121 ng/mL時，敏感性為80.0%，特異性為66.7%，P<0.0001(圖3a)。PS-PLA1診斷SLE的ROC曲線結(jié)果顯示：AUC為0.739，SE=0.036，95%CI=0.669～0.810，最佳臨界值為0.427，PS-PLA1水平≥31.670 ng/mL時，敏感性為71.300%，特異性為71.400%，P<0.0001(圖3b)。

圖2 SLE患者PS-PLA1表達水平與C3、C4、CRP和SLEDAI評分相關(guān)分析

3a:PS-PLA1評價SLE疾病活動性的ROC曲線;3b:PS-PLA1診斷SLE的 ROC曲線

3 討論

SLE是一種可以累及皮膚、腎臟、關(guān)節(jié)等多器官系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)多種多樣，預(yù)后差，死亡率高[5]。目前研究認為SLE是在遺傳和環(huán)境因素相互作用下機體發(fā)生免疫反應(yīng)異常[6]，機體細胞凋亡加速，凋亡細胞清除機制受損，暴露的自身抗原誘導(dǎo)樹突狀細胞激活Th1和Th2細胞促進自身反應(yīng)性B細胞產(chǎn)生大量自身抗體和多種細胞因子，形成免疫復(fù)合物，最終導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥和多器官損傷[7-9]。臨床上，SLE疾病活動評價主要采用SLEDAI評分、BILAG量表、ECLAM評分、SLAM評價體系等對疾病的活動進行評價，但因其相對繁瑣，臨床應(yīng)用受到一定限制。臨床上抗dsDNA抗體診斷SLE特異性高但敏感性低、CRP和C3診斷SLE敏感性高，但其干擾因素較多，對疾病活動判斷的特異性較差。因此，探尋一個敏感性和特異性高、臨床檢測便捷的SLE病情活動性評價指標，對于臨床SLE的治療評價極其重要。

研究顯示SLE患者體內(nèi)凋亡細胞明顯增多，胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露在胞膜脂質(zhì)雙分子層的外葉，成為細胞凋亡的標志，發(fā)出“Eat-Me”信號，誘導(dǎo)巨噬細胞迅速吞噬降解凋亡細胞[10]。PS-PLA1是胰脂肪酶基因家族中磷脂酶A1(PLA1)的成員之一，對PS有嚴格的底物特異性，能夠在sn-1位點高效水解暴露于細胞膜外的PS并生成溶血磷脂酰絲氨酸(LysoPS)[11]，使巨噬細胞和樹突狀細胞對凋亡細胞的識別減弱，引起凋亡清除過程的延遲和受損[12]，提示PS-PLA1在凋亡缺陷機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，隨著對PS-PLA1的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌和黑素瘤中腫瘤細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移[11，13]、丙型肝炎病毒復(fù)制[14]以及甲狀腺功能亢進[15]等自身免疫性疾病的發(fā)病機制發(fā)揮重要作用。

PS-PLA1血清水平升高一定程度上反映細胞凋亡清除缺陷引起的針對自身抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)加重，因此，SLE患者PS-PLA1血清水平可以反映機體自身免疫性炎癥輕重程度。Sawada等[16]研究證實，161例SLE患者血清PS-PLA1明顯高于健康對照組，且與疾病活動度呈正相關(guān)，治療后PS-PLA1水平明顯下降。本研究也獲得相似結(jié)果，而且SLE患者血清PS-PLA1血清水平與CRP、抗dsDNA抗體陽性率和SLEDAI評分呈顯著正相關(guān)，與補體C3和C4呈負相關(guān)。PS-PLA1對SLE疾病活動高低評價的敏感性與特異性分別為80.0%、66.7%，對SLE診斷的敏感性與特異性分別為71.3%、71.4%。由此可見，PS-PLA1可望成為SLE診斷及病情評估的潛在生物標志物。

近年研究顯示[17]動脈粥樣硬化等心血管事件已逐漸成為SLE患者晚期死亡的主要原因之一。在動脈內(nèi)膜脂蛋白異常沉積的基礎(chǔ)上，特異性的免疫異常在粥樣斑塊的形成與發(fā)展發(fā)揮重要作用。文獻報道[18]，PS-PLA1水解PS的產(chǎn)物LysoPS是一類新型的生物活性脂類，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞中粘附分子和趨化因子的表達、平滑肌細胞的遷移，亦能結(jié)合血小板表面高表達的LysoPS受體，活化血小板，可能參與SLE動脈粥樣硬化疾病的發(fā)病過程。因此，PS-PLA1的異常升高可能通過上述途徑間接參與SLE心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程。因我們收集患者樣本量偏差，合并心血管事件患者比例較少，故未能進行相關(guān)性評價，需要我們后續(xù)進一步深入探究。研究結(jié)果表明，PS-PLA1表達在狼瘡腎炎組與非狼瘡腎炎組無明顯差異，提示PS-PLA1作為指標診斷SLE是否合并狼瘡腎炎的價值有限。

綜上，本研究表明SLE患者血清PS-PLA1水平顯著高于健康人群，且其表達水平與SLE疾病活動度呈正相關(guān)，因此，血清PS-PLA1對評估SLE疾病活動性具有重要價值，可能成為SLE臨床診斷及治療評價的潛在生物學標志。由于本組研究樣本量有限，同時未能對患者進行縱向隨訪評價，具有一定局限性，需要我們后期進一步深入研究驗證。