楊思琪，張長(zhǎng)城，馬瓊艷，尤 旭，楊 圓，張 艷，袁 丁，趙海霞

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌 443002

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展及人們生存壓力的不斷提高，不孕不育已成為一個(gè)全球性問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，全世界約有15%的夫婦患有不育癥，其中男性因素約占50%，而其機(jī)制尚不十分清楚[1]。睪丸支持細(xì)胞作為唯一與生精細(xì)胞相連的體細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)上包繞精原干細(xì)胞、精原細(xì)胞及各級(jí)生精細(xì)胞，通過(guò)多種緊密連接蛋白如閉合蛋白(Occludin)和密封蛋白-1(Claudin-1)等形成血睪屏障[2]。研究顯示，睪丸支持細(xì)胞分泌各種生長(zhǎng)因子如膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein-4，BMP4)和干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)等，調(diào)控精原干細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)精子形成[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期暴露于六價(jià)鉻的雄性大鼠成年后支持細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡增多，精子生成障礙[4]。在熱應(yīng)激刺激下，牛睪丸支持細(xì)胞發(fā)生損傷，GDNF、SCF mRNA水平下調(diào)，致使精子發(fā)生障礙。因此，改善支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能可能是治療男性不育癥的新方向。

淫羊藿是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕的功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示淫羊藿具有顯著的延緩衰老和增強(qiáng)雄性生殖功能的作用，其主要活性成分為淫羊藿苷(icariin，ICA)。研究發(fā)現(xiàn)，ICA可促進(jìn)大鼠原代Sertoli 細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)雄性大鼠Sertoli細(xì)胞的功能[5]。研究顯示，ICA可通過(guò)升高支持細(xì)胞卵泡刺激素受體和緊密連接蛋白Claudin-11 mRNA表達(dá)水平，提高睪丸組織的抗氧化應(yīng)激能力，從而增強(qiáng)大鼠生殖功能[6]。核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid like 2，Nrf2)作為機(jī)體細(xì)胞防御系統(tǒng)的主要管理者，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element，ARE)的基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域中的增強(qiáng)子序列結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列編碼抗氧化蛋白和氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白等基因的表達(dá)，協(xié)調(diào)對(duì)各種應(yīng)激條件和有害攻擊的微調(diào)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[7.8]。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可通過(guò)激活Nrf2減輕氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝損傷[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA可通過(guò)上調(diào)Nrf2減輕自然衰老大鼠睪丸生殖細(xì)胞DNA損傷。ICA可上調(diào)D-Gal誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞株TM4細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin和Claudin-1的蛋白表達(dá)。然而，ICA能否通過(guò)Nrf2信號(hào)通路改善D-Gal導(dǎo)致的15P-1細(xì)胞損傷，目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道。前期研究顯示，D-Gal可以誘導(dǎo)的小鼠睪丸支持細(xì)胞株TM4細(xì)胞緊密連接損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)誘導(dǎo)的15P-1細(xì)胞為損傷模型，從Nrf2信號(hào)通路探討ICA對(duì)支持細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞株

小鼠睪丸支持細(xì)胞株15P-1細(xì)胞購(gòu)自上海通派生物細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥物及試劑

DMEM、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(Science Cell公司)；D-Gal(Sigma公司)；ICA單體(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)，純度98.61%?？俁NA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物科技有限公司)；PCR擴(kuò)增試劑(Thermo Scientific公司)；PCR相關(guān)引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；ECL顯影液(碧云天生物技術(shù)研究所)；β-actin(4970L，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；醌氧化還原酶-1[NAD(P)H quinone oxidoreductase-1，NQO-1](GB11282)、血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)(10701-1-AP)(武漢谷歌生物科技有限公司)；GDNF(ab18956)、BMP4(ab39973)、Nrf2(ab31163)(美國(guó)Abcam公司)；SCF(sc-13126)、Occludin(sc-5562)、Claudin-1(sc-166338)(美國(guó)Santa Cruze公司)；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(武漢科瑞有限公司)。

1.1.3 主要儀器

CKX41型光學(xué)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FORMA series Ⅱ二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；SW-4T-2F型超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠)；TD25-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南省湘儀儀器有限公司)；Centrifuge 5424 R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；HVA-85型高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；NANODROP 200型核酸蛋白檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；StepOne Plus型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosysterms公司)；Gellogic 212型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Kodak公司)；Power Pac TM Basic電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Bioshine Chemic Q 4800化學(xué)發(fā)光凝膠成像自動(dòng)顯影儀(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)；A1R+激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 15P-1細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇15P-1細(xì)胞，用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 15P-1細(xì)胞分組及處理

前期我們采用100和150 mM D-Gal刺激15P-1細(xì)胞，Western blot及半定量PCR檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)行模型條件的摸索，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇150 mM D-Gal進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。15P-1細(xì)胞按每孔5×104個(gè)/mL接種至六孔板中，分為對(duì)照組、D-Gal處理組、D-Gal+ICA(0.5 μM)組和D-Gal+ICA(1.0 μM)組。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)基。Control組更換新鮮培養(yǎng)基，D-Gal處理組加入150 mM 的含D-Gal的培養(yǎng)基，D-Gal+ICA(0.5 μM)組加入含150 mM的D-Gal及0.5 μM ICA的培養(yǎng)基，D-Gal+ICA(1.0 μM)組加入含150 mM 的D-Gal及1.0 μM ICA的培養(yǎng)基刺激48 h。

1.2.3 MTT法篩選ICA適用濃度

將15P-1細(xì)胞按5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL。待細(xì)胞長(zhǎng)出形態(tài)后，設(shè)置調(diào)零組、正常對(duì)照組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)、D-Gal組、D-Gal+DMSO對(duì)照組、D-Gal+ICA組，每組5個(gè)復(fù)孔，給予不同濃度(0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 μM)ICA預(yù)保護(hù)20 h后，吸去原培養(yǎng)基，正常對(duì)照組加入新配制的培養(yǎng)基，D-Gal處理組加入終濃度為150 mM D-Gal的新配制的培養(yǎng)基，D-Gal+ICA組加入終濃度為150 mM D-Gal及ICA終濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 μM的新配制的培養(yǎng)基，刺激48 h后在每孔中加入終濃度為0.5 g/L MTT(5 g/L，PBS配制) 20 μL，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h后去掉上清液，每孔加入150 μL DMSO后放在搖床上搖10 min后于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)出OD值。最后通過(guò)細(xì)胞活力的計(jì)算公式：細(xì)胞活力=[A加藥組-A調(diào)零組]/[A正常對(duì)照組-A調(diào)零組] ×100%，計(jì)算出各組的細(xì)胞的活力。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)15P-1細(xì)胞相關(guān)因子GDNF、BMP4和SCF mRNA表達(dá)水平

將六孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸除上清，每孔加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞后，每組加入1 mL Trizol裂解液，提取總RNA。檢測(cè)其完整性，核酸儀測(cè)定其濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×PCR Master mix，10.5 μL ddH2O，分別加入0.5 μL GDNF、BMP4和SCF上下游引物，最后加入1 μL cDNA模板，引物序列見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)條件：①變性：94 ℃ 30 s；②退火：57 ℃ 30 s；③延伸：72 ℃ 30 s;共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀拍照，用Image J軟件掃描條帶的吸光度(A)。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)15P-1細(xì)胞功能相關(guān)蛋白GDNF、BMP4、SCF、Occludin和Claudin-1及Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)水平

將六孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸除上清，每孔加入1 mL PBS 洗滌細(xì)胞后，收集細(xì)胞。在收集好的各組細(xì)胞中加入100 μL裂解液，渦旋儀上劇烈振蕩30 s，冰盒中靜置15 min，共震蕩3次，使細(xì)胞充分裂解。經(jīng)4 ℃、12 000 rpm離心10 min后取上清，采用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度，定量后的蛋白樣品加入上樣緩沖液，于100 ℃水浴變性10 min。將蛋白樣品進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，PVDF膜放置于50 g/L脫脂牛奶封閉液中室溫封閉1 h，分別加入鼠抗Claudin-1(1∶1 000)、兔抗Occludin(1∶2 000)、兔抗GDNF抗體(1∶1 000)、兔抗BMP4抗體(1∶1 000)、鼠抗SCF抗體(1∶1 000)、兔抗Nrf2抗體(1∶1 000)、鼠抗NQO-1抗體(1∶500)、兔抗HO-1抗體(1∶1 000)、兔抗 β-actin 抗體(1∶5 000)，4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜；次日，TBST洗膜，加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG(1∶5 000)或HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h；TBST洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光于凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)Nrf2表達(dá)及定位

將無(wú)菌圓形蓋玻片放入24孔板中，無(wú)菌PBS洗凈玻片上殘留的酒精，將GC-1細(xì)胞懸液接種到無(wú)菌玻片上。待GC-1細(xì)胞長(zhǎng)出形態(tài)后，按照“1.2.3”處理細(xì)胞后棄掉上清，PBS洗滌細(xì)胞，每5 min更換一次PBS，共洗滌20 min。洗滌完成后，4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后PBS洗滌細(xì)胞，每5 min更換一次PBS，共洗滌20 min。后經(jīng)0.1% Triton X-100打孔15 min，PBS洗滌細(xì)胞，每5 min更換一次PBS，共洗滌20 min。1% BSA于溫度為25 ℃下封閉1 h，棄掉封閉液后，置于4 ℃冰箱孵育一抗。一抗孵育完成后，25 ℃復(fù)溫30 min以上，PBS洗滌細(xì)胞，期間每5 min更換一次PBS。于37 ℃的溫度下避光孵育熒光二抗1 h，用PBS洗滌細(xì)胞后，避光孵育DAPI(0.5 μg/mL)5 min，PBS洗滌后封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察取圖。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞活力的影響

用不同濃度ICA處理15P-1細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)ICA濃度在2.5 μM以下時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯影響；將15P-1細(xì)胞分為對(duì)照組、150 mM D-Gal處理組、150 mM D-Gal +DMSO處理組、150 mM D-Gal加不同濃度ICA(0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 μM)處理組，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。與D-Gal處理組相比，ICA濃度為0.5和1 μM時(shí)，對(duì)15P-1細(xì)胞活力有明顯的保護(hù)作用，因此后續(xù)我們選擇ICA用藥濃度為0.5和1 μM研究D-Gal誘導(dǎo)15P-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

2.2 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞形態(tài)的影響

光鏡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-Gal處理組中，15P-1細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，而ICA干預(yù)后明顯改善(見(jiàn)圖2)。

圖2 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞形態(tài)的影響(400×)

2.3 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞相關(guān)因子GDNF、BMP4和SCF mRNA水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-Gal處理組GDNF、BMP4和SCF mRNA水平均顯著下調(diào)，提示D-Gal處理后，15P-1細(xì)胞功能下降，而給予ICA干預(yù)后，GDNF、BMP4和SCF的mRNA水平均顯著上升(見(jiàn)圖3)。

圖3 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞相關(guān)因子GDNF、BMP4和SCF mRNA水平的影響

2.4 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞相關(guān)因子GDNF、BMP4和SCF蛋白表達(dá)水平的影響

結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，D-Gal處理組15P-1細(xì)胞因子GDNF、BMP4和SCF蛋白水平均顯著下調(diào)，而ICA干預(yù)后可顯著升高GDNF、BMP4和SCF蛋白水平，提示ICA可以改善D-gal所致15P-1細(xì)胞功能下降。

圖4 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞相關(guān)因子GDNF、BMP4和SCF蛋白表達(dá)水平的影響

2.5 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin和Claudin-1蛋白表達(dá)水平的影響

與Control組比較，D-Gal可誘導(dǎo)15P-1細(xì)胞Occludin和Claudin-1蛋白水平的顯著下調(diào)，而ICA則可顯著上調(diào)Occludin和Claudin-1蛋白水平，提示ICA對(duì)D-Gal所致15P-1細(xì)胞緊密連接損傷有明顯的改善作用，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin和Claudin-1蛋白表達(dá)水平的影響

2.6 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，D-Gal處理組15P-1細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，而ICA干預(yù)后，15P-1細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著上升(見(jiàn)圖6)。

圖6 ICA對(duì) Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)水平的影響

2.7 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞中Nrf2表達(dá)及定位的影響

結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組相比，D-Gal處理組胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯降低，而給予ICA干預(yù)后，胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯上升。

圖7 ICA對(duì)15P-1細(xì)胞中Nrf2表達(dá)及定位的影響

3 討論

近年來(lái)，不育已被WHO確認(rèn)為一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題，在普通人群中發(fā)病率逐年增高，影響了全球約15%的育齡期夫婦[1]。調(diào)查研究顯示，在美國(guó)以及其他西方國(guó)家中，精子數(shù)量每年減少1.5%，據(jù)估計(jì)，全球近7 000萬(wàn)對(duì)夫婦已成為不育癥或不育癥的受害者[10]。在WHO進(jìn)行的一項(xiàng)大型流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約有一半的夫婦不育是由男性因素造成的，而其機(jī)制尚不十分清楚[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，D-Gal可使小鼠支持細(xì)胞系TM4細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞功能下降[12]。因此，我們選擇D-Gal模型來(lái)評(píng)估ICA是否能減輕15P-1細(xì)胞損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道，35、70、140 μM ICA處理血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304后，細(xì)胞抑制率為1.2%，無(wú)明顯細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ICA單獨(dú)處理15P-1細(xì)胞時(shí)，濃度為40 μM時(shí)IC50大于50%，提示ICA無(wú)明顯細(xì)胞毒性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA對(duì)D-Gal處理TM4細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，且在0.5和1 μM濃度下有明顯促增殖作用[13]。而本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果也顯示，與D-Gal處理組相比，ICA在0.125～1 μM以濃度依賴(lài)方式增加細(xì)胞存活率，在0.5和1 μM濃度下有明顯促細(xì)胞增殖作用，ICA濃度大于1 μM時(shí)促增殖作用較前減弱，可能是由于本實(shí)驗(yàn)中D-Gal刺激15P-1細(xì)胞時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)胞損傷較重，損傷的細(xì)胞對(duì)藥物刺激的敏感性大大增加，從而表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的現(xiàn)象。

睪丸支持細(xì)胞是定位于睪丸生精小管內(nèi)與生精細(xì)胞直接相連的體細(xì)胞，通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子如GDNF、BMP4及SCF等，調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)精子形成。GDNF是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的一員，是調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞增殖的重要因子，在雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育和睪丸早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用。BMP4和SCF是促進(jìn)精原干細(xì)胞分化的重要因子[14]。本課題組前期研究顯示，淫羊藿總黃酮可上調(diào)自然衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞分泌因子GDNF、BMP4及SCF mRNA和蛋白水平，改善支持細(xì)胞分泌功能[15]。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-Gal處理后支持細(xì)胞分泌因子mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降，而給予ICA后15P-1支持細(xì)胞分泌因子mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)。提示ICA能改善15P-1睪丸支持細(xì)胞的分泌功能。

支持細(xì)胞間緊密連接是血睪屏障最重要的組成部分，主要包括Occludin、Claudin、黏附蛋白三個(gè)跨膜蛋白家族及閉鎖連接胞漿蛋白家族[16]，細(xì)胞間緊密連接不僅可以保護(hù)生殖細(xì)胞不受免疫系統(tǒng)的侵害，給精子發(fā)生提供一個(gè)良好的生理環(huán)境，而且還允許前細(xì)線(xiàn)期精母細(xì)胞和后細(xì)線(xiàn)期精母細(xì)胞規(guī)律的通過(guò)血睪屏障，以便進(jìn)一步發(fā)育[17]。研究發(fā)現(xiàn)，Occludin和Claudin是最早被鑒定的緊密連接整膜蛋白[18]，而緊密連接能力和上皮屏障功能主要由Claudins介導(dǎo)。另有研究顯示，在大鼠睪丸內(nèi)注射合成的Occludin肽，可在27天后可逆的消融大部分精原細(xì)胞，而在體外敲除Occludin也會(huì)導(dǎo)致支持細(xì)胞緊密連接功能下降[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-Gal處理后15P-1細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)下降，而給予ICA后15P-1支持細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。提示ICA對(duì)15P-1支持細(xì)胞緊密連接蛋白損傷有保護(hù)作用。

機(jī)體處于正常狀態(tài)下，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)募集Nrf2，在細(xì)胞質(zhì)中形成一種復(fù)合物經(jīng)泛素蛋白酶降解；當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)Nrf2與Keap1解離，Nrf2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核結(jié)合ARE，激活下游HO-1和NQO1等大量保護(hù)性基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抵抗各種刺激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷[20]。本課題組前期研究顯示，ICA可通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，減輕自然衰老大鼠睪丸DNA損傷，改善衰老所致的生殖功能衰退，提示ICA改善生精功能障礙可能與Nrf2信號(hào)通路有關(guān)。前期研究顯示，ICA可改善D-Gal誘導(dǎo)的睪丸支持細(xì)胞株TM4細(xì)胞損傷。因此，本研究采用Western blot法檢測(cè)Nrf2通路蛋白，研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-Gal刺激后15P-1細(xì)胞內(nèi)Nrf2通路重要蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，而給予ICA后均顯著上升。隨后我們采用免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)了Nrf2的表達(dá)及定位，與正常對(duì)照組相比，D-Gal處理組15P-1細(xì)胞中胞核內(nèi)Nrf2熒光表達(dá)減弱，而給予ICA后有所改善。以上結(jié)果提示，15P-1細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)損傷與Nrf2信號(hào)通路下調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力下降有關(guān)，而ICA可能通過(guò)提高15P-1細(xì)胞抗氧化能力進(jìn)而改善其損傷。

綜上所述，ICA可以通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)15P-1細(xì)胞分泌相關(guān)蛋白GDNF、BMP4和SCF及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin和Claudin-1的表達(dá)水平，進(jìn)而改善D-Gal誘導(dǎo)的15P-1細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)為我們后續(xù)研究ICA對(duì)生殖細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)，以期更好的發(fā)掘中草藥淫羊藿在生殖系統(tǒng)中的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為臨床上治療男性不育癥提供了新的方向。