李佩佩，郝 鈺，楊 磊

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院麻醉科；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)骨傷科，銀川 750004

盡管全身麻醉被認(rèn)為是世界上數(shù)百萬診所每天都采用的安全且常規(guī)的醫(yī)療程序，但是近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，全身麻醉可能會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重和不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)損傷，尤其是在年輕和嬰兒患者中[1]。在幾種廣泛使用的麻醉藥中，芬太尼被證實(shí)在動物模型中可誘導(dǎo)神經(jīng)元生長錐塌陷，神經(jīng)突變性和其他組織病理學(xué)損害。近年來的研究指出，藥物或遺傳干預(yù)可以對芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性發(fā)揮挽救作用，例如地塞米松可通過PI3K/Akt和ERK信號通路減輕芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷[2,3]。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是由BDNF基因編碼的一種生物活性蛋白，屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，集中分布于神經(jīng)系統(tǒng)，通過與其高親和力原受體酪氨酸激酶受體(Trk)相結(jié)合從而調(diào)節(jié)其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元及突觸的生長，成熟，分化以及存活等過程中發(fā)揮重要作用，并通過抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)維持成熟神經(jīng)元，發(fā)揮長時程增強(qiáng)作用，進(jìn)而促進(jìn)理解和記憶能力，此外BDNF/Trk還可通過與中腦邊緣葉的多巴胺能系統(tǒng)相互作用，調(diào)節(jié)多巴胺釋放,誘導(dǎo)多巴胺相關(guān)行為，改善或惡化認(rèn)知和記憶功能。動物實(shí)驗(yàn)指出，敲除受體酪氨酸激酶受體基因的小鼠長時程增強(qiáng)顯著受損，理解和記憶能力顯著損傷[4-6]?；⒄溶諡檐晤愑袡C(jī)化合物，是我國傳統(tǒng)中藥虎杖的干燥根莖中分離提取的天然活性成分之一，近年來的研究指出虎杖苷可以通過增加自由基清除或誘導(dǎo)淀粉β蛋白降解來預(yù)防神經(jīng)退行性疾病，包括帕斯病或阿爾茨海默氏病[7,8]，但是，目前虎杖苷是否在麻醉誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性中發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)功能性作用尚不清楚，因此，我們通過使用虎杖苷預(yù)處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以檢測虎杖苷對芬太尼麻醉后的神經(jīng)保護(hù)功能及其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

聚D賴氨酸、10%胎牛血清、青霉素鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、成像載玻片(Thermo Fisher Scientific，美國)；玻璃蓋玻片、12孔板(CST，美國)；虎杖苷和芬太尼(Sigma Aldrich，美國)；TrkA封閉抗體、非特異性IgG抗體(Creative Biolabs，美國)；RBFOX3/NeuN抗體(Novus，美國)；Click-iT TUNEL Alexa Fluor 468成像分析儀，TRIzolTMPlus RNA純化試劑盒，抗TrkA、TrkB、TrkC兔多克隆抗體，抗磷酸化TrkA、TrkB、TrkC兔多克隆抗體，抗cleaved-Caspase-9抗體，ECL Plus試劑(Invitrogen，美國)；Caspase-9抗體(Abcam，中國)；Axiovert顯微鏡(Zeiss，德國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(羅氏，美國)；SYBR Green Mix(TOYOBO，日本)；TrkA、TrkB和TrkC的引物(Sangon Biotech，中國)；RIPA裂解緩沖液、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠、PVDF膜(Beyotime，中國)；ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；ImageJ軟件(NIH，美國)。

1.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞的體外培養(yǎng)

從寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購買5周大的C57BL/6小鼠，飼養(yǎng)于大學(xué)動物試驗(yàn)中心，環(huán)境溫度22～26 ℃，濕度45%～55%，自由飲食飲水，飼養(yǎng)一周后用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉并通過頸椎脫臼法迅速處死，無菌條件下快速提取小鼠海馬神經(jīng)組織，將分離海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種在層粘連蛋白/聚D賴氨酸的玻璃蓋玻片的12孔板中，并在補(bǔ)充10%胎牛血清和青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中孵育，在5%CO2的濕潤組織培養(yǎng)箱中，37 ℃下培養(yǎng)。

1.3 藥物處理

虎杖苷(polydatin)和芬太尼(fentanyl)在DMSO中溶解，并在培養(yǎng)基中稀釋至工作濃度，NMAC13(TrkA封閉抗體)和非特異性IgG抗體于TBST中稀釋至工作濃度。

虎杖苷預(yù)處理組：將海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物用濃度為(0.01、0.05、1、5、10、50、100 μM)的虎杖苷預(yù)處理12 h，除去虎杖苷后使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使用5 mM芬太尼處理2 h后將培養(yǎng)基更換為常規(guī)培養(yǎng)基，孵育24 h；陰性對照組細(xì)胞使用5 mM 芬太尼處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞 2 h，將培養(yǎng)基更換為常規(guī)培養(yǎng)基，室溫孵育24 h；然后進(jìn)行TUNEL、qRT-PCR和Western blot分析。

使用NMAC13(20 μg/mL，NMAC13組)或IgG(20 μg/mL，IgG對照組)處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞 24 h后用虎杖苷(50 μM)處理12 h，除去虎杖苷后使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使用5 mM芬太尼處理2 h后將培養(yǎng)基更換為常規(guī)培養(yǎng)基，孵育24 h，然后進(jìn)行TUNEL、qRT-PCR和Western blot分析。

1.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

PBS洗滌三次后，鋪好至多聚賴氨酸載玻片上，4%多聚甲醛中固定25 min，室溫孵育過夜，根據(jù)制造商說明書，添加Alexa Fluor 647偶聯(lián)的RBFOX3/NeuN抗體，避光孵育45 min后，從12孔板中取出蓋玻片并置于成像載玻片上，使用Click-iT TUNEL Alexa Fluor 468成像分析儀評估海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

將獲取的小鼠海馬神經(jīng)組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片處理后，用二甲苯脫蠟并用梯度乙醇和蒸餾水處理，在沸騰的0.01 M檸檬酸鹽緩沖液中加熱90 s后將切片冷卻，與3%過氧化氫溫育10 min后與Caspase-9抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，加入Max Vision TM，HRP標(biāo)記的小鼠二抗室溫孵育30 min，使用Axiovert顯微鏡觀察染色。

1.6 RNA提取和實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)

使用TRIzol?Plus RNA純化試劑盒從海馬神經(jīng)元細(xì)胞中提取總RNA，然后根據(jù)試劑商說明書使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Mix在C1000TM PCR儀上進(jìn)行QRT-PCR。小鼠Tropomyosin受體激酶A、B和C(TrkA、TrkB和TrkC)的引物購自Sangon Biotech。以β-肌動蛋白為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔCtCt方法將基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化，引物序列見表1。

表1 PCR所用引物序列

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析

當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后胰酶消化收集細(xì)胞，根據(jù)制造商的說明書，使用RIPA裂解緩沖液從海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中提取總蛋白，并使用BCA試劑盒進(jìn)行定量。對于每份樣品，將等量的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上120 V，90 min電泳，然后室溫轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。與相應(yīng)一抗室溫孵育過夜，包括抗TrkA兔多克隆抗體(1∶500)，抗TrkB兔多克隆抗體(1∶500)，抗TrkC兔多克隆抗體(1∶500)，抗磷酸化TrkA兔多克隆抗體(1∶500)，抗磷酸化TrkB兔多克隆抗體(1∶500)和抗磷酸化TrkC兔多克隆抗體(1∶500)，抗Caspase-9抗體(1∶500)，然后在室溫下孵育HRP偶聯(lián)的二抗室溫孵育2 h。用ECL Plus試劑進(jìn)一步增強(qiáng)印跡，并使用ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)對其進(jìn)行可視化。使用ImageJ軟件進(jìn)行光密度分析。以β-肌動蛋白為內(nèi)參進(jìn)行蛋白表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 動物實(shí)驗(yàn)

莫里斯水迷宮：將直徑為120 cm，高度為50 cm的圓形罐放置在黑暗的測試室中，黑暗測試室內(nèi)的水深高于平臺，圓形水箱分為四個相等的部分，分別設(shè)計(jì)用于北部，東部，南部和西部區(qū)域。將直徑為8 cm的黑色圓形平臺放置在恒定位置，該位置位于水箱的東北區(qū)域，其頂點(diǎn)在水平面以下1 cm，水用無毒的黑色染料染色，水下平臺的位置不可見。在所有實(shí)驗(yàn)中，將動物從水箱的西南象限釋放，找到平臺后，讓小鼠在平臺上停留30 s，每只小鼠每天定期訓(xùn)練4次，使其最終找到水下潛藏平臺的時間低于60 s。

隨機(jī)將訓(xùn)練后的小鼠分為對照組和虎杖苷組，對照組腹腔注射芬太尼(5 mg/kg)，每三天一次，虎杖苷組腹腔注射芬太尼(5 mg/kg)和虎杖苷(10 mg/kg)進(jìn)行聯(lián)合處理，每三天一次，持續(xù)處理兩周后進(jìn)行莫里斯水迷宮測試以評估虎杖苷組和對照組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，視頻跟蹤系統(tǒng)記錄尋找逃生平臺的時間，找到隱藏平臺的時間作為學(xué)習(xí)能力指標(biāo)，撤去水下平臺，記錄小鼠在1 min內(nèi)越過原始平臺的時間和保留時間，以評估其學(xué)習(xí)和記憶功能。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)進(jìn)行三次，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。使用SPSS軟件17.0(SPSS，美國)對所有統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行Studentt檢驗(yàn)。P<0.05時，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷抑制芬太尼誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

與對照組相比，芬太尼處理后，細(xì)胞凋亡增加(圖1A)；與芬太尼相比，虎杖苷預(yù)處理可顯著降低芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡(圖1A)，此外在50 μM處虎杖苷處理顯示出最大的神經(jīng)元凋亡抑制作用，故后續(xù)選擇此劑量。

圖1 虎杖苷對芬太尼誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用

2.2 虎杖苷抑制Caspase-9表達(dá)

與對照組相比，芬太尼處理后，Caspase-9和cleaved-Caspase-9表達(dá)增加(P<0.05)；與芬太尼相比，虎杖苷預(yù)處理組Caspase-9與cleaved-Caspase-9表達(dá)降低(P<0.05，圖2)。

圖2 虎杖苷抑制芬太尼誘導(dǎo)的Caspase-9的表達(dá)

2.3 虎杖苷激活芬太尼處理后海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的TrkA與BDNF

與芬太尼相比，虎杖苷預(yù)處理組TrkA，TrkB或TrkC基因表達(dá)沒有顯著差異(圖2A，P>0.05)，BDNF轉(zhuǎn)錄水平顯著增加(圖2A，P<0.05)，TrkA，TrkB以及TrkC的蛋白表達(dá)也無顯著差異(圖2B～F，P> 0.05)，但BDNF和磷酸化TrkA的表達(dá)顯著增加(圖2B～C，2H～I(xiàn)，P<0.05)。

2.4 虎杖苷通過TrkA信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

與IgG對照組相比，MNAC13組TrkA蛋白表達(dá)未受影響，但BDNF和磷酸化TrkA蛋白表達(dá)顯著降低(圖4A和4B，P>0.05)，細(xì)胞凋亡顯著增加(TUNEL陽性)(圖4C～D，P<0.05)。

圖4 虎杖苷通過TrkA信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

2.5 虎杖苷改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力

與對照組相比，芬太尼處理后，小鼠到達(dá)目標(biāo)象限和穿越平臺的時間顯著增加，提示其學(xué)習(xí)記憶能力的下降(P<0.05，圖5A和5B)；與芬太尼相比，虎杖苷處理可顯著降低芬太尼誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶能力的下降(P<0.05，圖5A和5B)。

圖5 莫里斯水迷宮測試

3 結(jié)論

高濃度的全身麻醉藥(例如芬太尼)導(dǎo)致的麻醉持續(xù)狀態(tài)可能引起缺血性缺氧和水腫，并誘發(fā)興奮性氨基酸的釋放，鈉和鈣的流入以及Caspase蛋白家族的活化，而Caspase的表達(dá)增加進(jìn)一步激活下游效應(yīng)子，導(dǎo)致包括海馬神經(jīng)元細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并誘發(fā)各種病理改變，例如神經(jīng)元丟失和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性和持續(xù)性損害，尤其是海馬和其他邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)元的損害，雖然少見，但可能對年輕和嬰兒患者的發(fā)育中的大腦造成嚴(yán)重和永久的損害[9-12]，因此研究麻醉誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的潛在機(jī)制以及其有效預(yù)防藥物具有重要的臨床意義，而我們的研究發(fā)現(xiàn)芬太尼處理可以顯著誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，抑制TrkA的磷酸化激活，促進(jìn)Caspase-9的表達(dá)，損傷小鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力，而虎杖苷預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力的損傷。

圖3 虎杖苷對芬太尼處理的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中TrkA /B/C與BDNF的作用

虎杖為蓼科多年生灌木狀草本植物，以干燥根莖和根入藥，虎杖中主要含有蒽醌類、黃酮類以及酚類化合物，具有有多種藥理作用，包括抗炎，抗病毒，抗菌，調(diào)血脂，抗血栓，心肌保護(hù)，抗氧化，抗腫瘤，神經(jīng)保護(hù)的作用[13]?；⒄溶帐菑钠涓稍锔o部中提取而來的活性成分，研究表明虎杖苷具有良好神經(jīng)保護(hù)作用，可以通過進(jìn)GLI-1(膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白1)和SOD1(超氧化物歧化酶)的表達(dá)，下調(diào)NF-κB(核因子κB)活性，改善血腦屏障，進(jìn)而保護(hù)腦中動脈缺血對大腦造成的損傷，減輕學(xué)習(xí)記憶障礙，改善認(rèn)知障礙[14,15]；在脊髓損傷的體內(nèi)動物模型中，虎杖苷可通過增加超氧化物歧化酶，減少丙二醛和抑制凋亡相關(guān)信號通路而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16-18]。最近研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后使用鞘氨醇處理可以通過激活Caspase-9/Caspase-3來促進(jìn)海馬神經(jīng)元的凋亡，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，損害學(xué)習(xí)和記憶能力，而虎杖苷可以通過神經(jīng)營養(yǎng)信號通路保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元免受缺血性損傷，并通過下調(diào)Caspase-9抑制Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)的激活，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，進(jìn)而改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[19-22]。我們的研究結(jié)果顯示，虎杖苷可以顯著抑制芬太尼誘導(dǎo)的Caspase-9上調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。

原肌球蛋白受體激酶(Trk)受體(包括TrkA、TrkB和TrkC)在海馬神經(jīng)元發(fā)育過程中動態(tài)表達(dá)，通過與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合發(fā)生磷酸化，進(jìn)而啟動相關(guān)信號通路，并與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路相互作用以調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元的成熟，分化，存活，突觸重塑或損傷，研究指出，通過激活神經(jīng)營養(yǎng)信號通路中的TrkA/B可以會降低麻醉誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[23-25]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可以通過上調(diào)磷酸化激活的TrkA，顯著抑制芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

總之，我們的結(jié)果表明虎杖苷可以通過抑制Caspase-9的上調(diào)，促進(jìn)TrkA的磷酸化激活降低芬太尼誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。