顧 婷，和 英，肖培云，楊永壽

大理大學(xué)藥學(xué)院，大理 671000

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)是蜚蠊屬中最大的昆蟲(chóng)之一[1]。蜚蠊藥用價(jià)值在《神農(nóng)本草經(jīng)》和明代的《本草綱目》早有記載[2]。20世紀(jì)80年代以來(lái)，以李樹(shù)楠教授為主的科研人員致力于美洲大蠊的藥用研究，將人工飼養(yǎng)的美洲大蠊乙醇提取物內(nèi)服或者外用，用于治療潰瘍、癌癥等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊的化學(xué)成分包括：蛋白質(zhì)、氨基酸、肽類、糖類、脂肪酸、信息素及其他，有抗腫瘤、抗肝纖維化、抑菌、抗病毒、抗氧化等生物活性[4]。

糖類物質(zhì)是地球上數(shù)量最多的有機(jī)化合物，占總生物量的3/4，而多糖類物質(zhì)約占其中總量的90%[5]。多糖的生物活性主要包括抗腫瘤、降血糖、抗衰老、增強(qiáng)骨髓造血機(jī)能、調(diào)節(jié)免疫等，且基本無(wú)毒副作用，因而受到人們的廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥領(lǐng)域極具應(yīng)用前景[6]。其活性與其相對(duì)分子質(zhì)量、化學(xué)組成、苷鍵構(gòu)型、連接方式和空間構(gòu)型有關(guān)[7]。為了解美洲大蠊多糖的特性，可以采用水解反應(yīng)，分析單糖組成及含量的變化，為美洲大蠊多糖的質(zhì)量控制提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)以美洲大蠊多糖為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以高效液相色譜圖中單糖總峰面積為指標(biāo)，利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化美洲大蠊多糖的水解工藝以獲得單糖含量最高的工藝，此外，對(duì)美洲大蠊多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究，為美洲大蠊多糖的結(jié)構(gòu)鑒定和后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AL240-IC型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HYQ-3110渦旋混勻器(美國(guó)精騏有限公司)。

1.2 材料

美洲大蠊藥材(云南省大理州彌渡縣美蠊養(yǎng)殖基地)經(jīng)大理大學(xué)云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊自忠教授鑒定為昆蟲(chóng)綱蜚蠊科昆蟲(chóng)美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.；葡萄糖(Glu，批號(hào)171206)、甘露糖(Man，批號(hào)170921)、半乳糖(Gal，批號(hào)171206)、鼠李糖(Rha，批號(hào)171024)、巖藻糖(Fuc，批號(hào)170831)、木糖(Xyl，批號(hào)170912)、鹽酸氨基葡萄糖(Gah，批號(hào)171210)、阿拉伯糖(Ara，批號(hào)171219)，均購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，以上單糖純度均﹥98%。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 美洲大蠊多糖提取

稱取500 g美洲大蠊藥材，料液比1∶10，60 ℃回流提取2次，2 h/次，4 000 rpm，離心15 min，取上清液，石油醚脫脂，60 ℃濃縮。加入4倍體積的95%乙醇溶液醇沉24 h，離心，取沉淀，加水溶解，加入1/4體積的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，震蕩10 min，離心，取水相，濃縮，冷凍干燥后即得美洲大蠊多糖。

2.2 PMP-HPLC衍生化法測(cè)定美洲大蠊多糖的單糖組成

2.2.1 美洲大蠊多糖水解液的配制

精密稱取美洲大蠊多糖20 mg，置安剖瓶中，1 mL蒸餾水溶解，加2 mol/L三氟乙酸(TFA)，充氮，熔封，置于烘箱中水解。將安剖瓶中水解液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，加少量甲醇洗滌安剖瓶，洗液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，50 ℃旋蒸至干，重復(fù)加甲醇，蒸干至無(wú)酸味。依次精加1、0.5、0.5 mL水超聲溶解樣品，并將其轉(zhuǎn)移至EP管中，離心即得美洲大蠊多糖水解液。

2.2.2 混合單糖對(duì)照品溶液的配制

精密稱取葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、鹽酸氨基葡萄糖、阿拉伯糖各約1 mg分別置EP管中，精加1 mL水溶解，即得各單糖對(duì)照品溶液。移液槍吸取葡萄糖50 μL、甘露糖30 μL、半乳糖40 μL、鼠李糖20 μL、巖藻糖10 μL、木糖10 μL、鹽酸氨基葡萄糖30 μL、阿拉伯糖15 μL至EP管中即得混合單糖對(duì)照品溶液。

2.2.3 衍生化反應(yīng)

精密吸取混合單糖對(duì)照品溶液100 μL和美洲大蠊多糖水解液200 μL，分別加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液與0.3 mol/L氫氧化鈉溶液各200 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min，冰浴冷卻，加250 μL 0.3 mol/L的鹽酸溶液，混勻。氯仿洗滌3次，每次2 mL，離心，取上清，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得單糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖PMP衍生物。

2.2.4 HPLC條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流動(dòng)相：A：0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.86)，B：乙腈。梯度洗脫條件(以B的比例記錄)：0～20 min，16.5→17%；20～35 min，17→22%；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)(n=3)

2.3.1 TFA用量考察

精密稱取美洲大蠊多糖5份，20 mg/份，置安剖瓶中，1 mL蒸餾水溶解，分別加入2、3、4、5、6 mL TFA，充氮，熔封。置于烘箱中，110 ℃水解8 h，后將安剖瓶中水解液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，加少量甲醇洗滌安剖瓶，洗液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，50 ℃旋蒸至干，重復(fù)加甲醇，蒸干至無(wú)酸味。依次精加1、0.5、0.5 mL水超聲溶解樣品，并將其轉(zhuǎn)移至EP管中，精密吸取美洲大蠊多糖水解液200 μL，分別加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液與0.3 mol/L氫氧化鈉溶液各200 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min，冰浴冷卻，加250 μL 0.3 mol/L的鹽酸溶液，混勻。氯仿洗滌3次，每次2 mL，離心，取上清，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，得多糖PMP衍生物，HPLC上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算單糖總峰面積。

2.3.2 水解時(shí)間考察

精密稱取美洲大蠊粗多糖5份，20 mg/份，置安剖瓶中，1 mL蒸餾水溶解，加3 mL TFA，充氮，熔封。置于烘箱中，110 ℃分別水解0.5、1、1.5、2、4 h，然后將安剖瓶中水解液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，后續(xù)操作與“2.3.1”項(xiàng)下一致，HPLC上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算單糖總峰面積。

2.3.3 水解溫度考察

精密稱取美洲大蠊粗多糖5份，20 mg/份，置安剖瓶中，1 mL蒸餾水溶解，加3 mL TFA，充氮，熔封。置于烘箱中，90、100、110、120、130 ℃水解1 h，然后將安剖瓶中水解液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，后續(xù)操作與“2.3.1”項(xiàng)下一致，HPLC上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算單糖總峰面積。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化美洲大蠊的水解工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Design-Expert 8.0.6 Trial軟件，運(yùn)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以水解時(shí)間、水解溫度、TFA用量三個(gè)因子為自變量，以美洲大蠊多糖水解出來(lái)的單糖總峰面積為響應(yīng)值，對(duì)美洲大蠊多糖的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.5 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。

2.6 美洲大蠊多糖抗氧化活性研究

2.6.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參照Li等[8]和Feng等[9]方法，并做相應(yīng)調(diào)整。精密稱取7.87 mg DPPH，無(wú)水乙醇定容至100 mL(0.02 mmol/L)。分別精取2 mL不同濃度(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的樣品和維生素C(Vc)溶液，精加2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，4 000 rpm離心10 min，取上清液于517 nm處測(cè)吸光度。

其中，A0：2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度；A1：2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；A2：2 mL樣品溶液+2 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

2.6.2 總還原能力的測(cè)定

參照Wang等[10]方法，并做相應(yīng)修改。在10 mL離心管中分別精取0.025 mol/L pH 6.86的磷酸鹽緩沖液2 mL和不同濃度(0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mg/mL)的樣品和Vc溶液2 mL，精加2 mL 1%鐵氰化鉀，混勻后于50 ℃反應(yīng)20 min。取出后精加2 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，4 000 rpm離心10 min。精取上清液2 mL，精加入2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測(cè)吸光度。

還原能力=A1-A2

其中，A1：樣品組吸光度；A2：樣品本底吸光度(以等體積蒸餾水代替FeCl3溶液)。

2.6.3 羥自由基清除率的測(cè)定

參照Li等[11]方法，并做相應(yīng)修改。精取9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1 mL，1 mL不同濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)的樣品及Vc溶液。精加1 mL 1% H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm處測(cè)定各濃度樣品的吸光度。

式中，A0：1 mL水楊酸+ 1 mL FeSO4+1 mL水+1 mL H2O2；A1：1 mL水楊酸+ 1 mL FeSO4+1 mL樣品+1 mL H2O2；A2：1 mL水楊酸+ 1 mL FeSO4+1 mL樣品+1 mL H2O。

2.6.4 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考Zhang等[12]方法，略作修改。將等體積7.4 mmol/L的ABTS和2.6 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液混合，室溫避光下靜置12～16 h，制成ABTS儲(chǔ)備液。用pH 7.4的磷酸緩沖液稀釋儲(chǔ)備液，使其在734 nm下的吸光度在(0.70±0.02)，制成ABTS工作液。精取不同濃度(0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 mg/mL)的多糖樣品及Vc溶液各1 mL，精加ABTS工作液6 mL，混合均勻，室溫下靜置6 min，測(cè)定734 nm下的吸光度。

其中，A0：1 mL 蒸餾水+ 6 mL ABTS工作液的吸光度；A1：1 mL樣品液+ 6 mL ABTS工作液的吸光度；A2：1 mL樣品液+ 6 mL蒸餾水的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

TFA用量考察結(jié)果：在水解溫度為110 ℃，水解時(shí)間8 h的條件下，TFA用量為3 mL時(shí)，單糖總峰面積達(dá)到最大；水解時(shí)間考察結(jié)果：在TFA用量為3 mL，水解溫度110 ℃條件下，水解1 h，單糖總峰面積達(dá)到最大；水解溫度考察結(jié)果：在TFA用量為3 mL，水解時(shí)間1 h的條件下，水解溫度為120 ℃時(shí)，單糖總峰面積達(dá)到最大。

3.2 美洲大蠊多糖水解的響應(yīng)面結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，PMP-HPLC柱前衍生法測(cè)定各組單糖總峰面積，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3)

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以單糖總峰面積Y對(duì)自變量進(jìn)行模型擬合，通過(guò)決定系數(shù)(R2)和方差分析對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項(xiàng)回歸擬合方程：Y=4 763.08 + 187.18A+78.31B+ 512.01C-626.70AB-283.90AC+242.27BC-505.05A2-782.48B2-957.93C2。

表3 回歸模型的方差分析

3.2.2 響應(yīng)面曲面分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，作出響應(yīng)面的3D和等高線分析圖，可以形象地反應(yīng)出各自變量對(duì)總峰面積的影響。由圖1～3可知，在所選范圍內(nèi)存在極值即響應(yīng)面最高點(diǎn)，也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)，曲面坡度大，說(shuō)明變化明顯；響應(yīng)面圖能較直觀反映出各因素與響應(yīng)值的關(guān)系及各個(gè)因素間的交互作用。此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖還可知，水解時(shí)間與水解溫度這兩者之間存在顯著的交互作用；而TFA用量和水解溫度之間無(wú)顯著交互作用；TFA用量和水解時(shí)間之間也無(wú)顯著交互作用；交互作用強(qiáng)弱為：AB>AC>BC，與方差分析結(jié)果一致。

圖1 水解時(shí)間和水解溫度等高線(a)及對(duì)單糖總峰面積(b)影響的響應(yīng)面

圖2 TFA用量和水解時(shí)間等高線(a)及對(duì)單糖總峰面積影響的響應(yīng)面圖(b)

圖3 TFA用量和水解溫度等高線(a)及對(duì)單糖總峰面積影響的響應(yīng)面圖(b)

3.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的最佳水解條件為：水解時(shí)間1.04 h，水解溫度120.62 ℃，TFA用量3.26 mL，模型預(yù)測(cè)值為4 839.97。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目尚行?，考察預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在優(yōu)化的工藝參數(shù)下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作條件，實(shí)際校正后將最佳工藝參數(shù)修正為：水解時(shí)間1 h，水解溫度120 ℃，TFA用量3.5 mL，所得總峰面積為4 740.15，與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為2.1%。圖4為優(yōu)化條件下測(cè)定的美洲大蠊單糖及標(biāo)準(zhǔn)單糖液相色譜圖。

圖4 混合對(duì)照品(A)及美洲大蠊單糖組成(B)HPLC色譜圖

3.3 美洲大蠊多糖抗氧化活性結(jié)果

3.3.1 美洲大蠊多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

用“2.6.1”項(xiàng)方法測(cè)定Vc和美洲大蠊多糖對(duì)DPPH自由基的清除曲線，見(jiàn)圖5，隨著給藥濃度的增加，Vc和美洲大蠊多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)，當(dāng)美洲大蠊多糖濃度為0.08 mg/mL時(shí)，清除率為88.34%，此時(shí)，Vc的清除率為96.43%。美洲大蠊多糖對(duì)DPPH自由基清除作用的IC50數(shù)值為0.028 mg/mL，結(jié)果顯示美洲大蠊多糖有一定的清除DPPH自由基的能力。

圖5 美洲大蠊多糖對(duì)DPPH自由基的清除率

3.3.2 美洲大蠊多糖的還原能力

用“2.6.2”項(xiàng)方法測(cè)定Vc和美洲大蠊多糖的總還原能力，結(jié)果見(jiàn)圖6，隨著多糖和Vc濃度的增加，美洲大蠊多糖的還原力都出現(xiàn)較為明顯的上升。當(dāng)Vc的濃度達(dá)到0.16 mg/mL時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，為1.214；而當(dāng)美洲大蠊多糖的濃度為0.16 mg/mL時(shí)，吸光度為0.667，雖還原能力不及Vc，但本實(shí)驗(yàn)仍能證明美洲大蠊多糖具有一定的還原能力。

圖6 美洲大蠊多糖的總還原能力

3.3.3 美洲大蠊多糖對(duì)OH自由基的清除能力

由圖7可知，在多糖濃度為0.4～1.6 mg/mL時(shí)，OH自由基清除率隨著多糖濃度的增加而增加，當(dāng)多糖濃度達(dá)到1.6 mg/mL時(shí)，清除率為94.28%，此時(shí)，Vc清除率為99.91%，二者清除能力較為接近。美洲大蠊多糖對(duì)OH自由基清除作用的IC50值為0.78 mg/mL，表明美洲大蠊多糖具有良好的清除OH自由基的能力。

圖7 美洲大蠊多糖對(duì)OH自由基的清除率

3.3.4 美洲大蠊多糖清除ABTS自由基的能力

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖8)可知，美洲大蠊多糖在0.01～0.16 mg/mL時(shí)，美洲大蠊多糖清除ABTS自由基能力曲線相對(duì)較陡，清除能力隨多糖濃度增加地較快；當(dāng)多糖在0.16～0.32 mg/mL時(shí)，曲線較平緩；當(dāng)多糖濃度為0.32 mg/mL，美洲大蠊多糖對(duì)ABTS自由基的清除率為97%，此時(shí)，Vc清除能力為102%。美洲大蠊多糖和Vc對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50值分別為0.07、0.035 mg/mL，表明美洲大蠊多糖有一定的清除ABTS自由基的能力。

圖8 美洲大蠊多糖對(duì)ABTS自由基的清除率

4 結(jié)論與討論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)美洲大蠊多糖的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。得到美洲大蠊多糖水解的最佳工藝條件為：水解時(shí)間1 h，水解溫度120 ℃，TFA用量3.5 mL，總峰面積為4 740.15。抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明，美洲大蠊多糖具有較好的抗氧化活性，其對(duì)DPPH、OH、ABTS自由基具有較好的清除能力，IC50分別為0.028、0.78、0.07 mg/mL，且具有一定的還原能力。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)霸王花多糖中半乳糖和阿拉伯糖的比例與其清除ABTS自由基的IC50存在一定的正相關(guān)性。Shang等[14]將5種食用真菌多糖的化學(xué)組成及單糖組成與抗氧化活性(IC50)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，巖藻糖、甘露糖和半乳糖的含量對(duì)多糖的ABTS自由基清除活力有影響；葡萄糖和甘露糖含量對(duì)多糖的OH自由基清除活力有顯著影響，巖藻糖含量和多糖的超氧陰離子的IC50值呈正相關(guān)。Ai[15]發(fā)現(xiàn)甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖對(duì)茶多糖抗氧化活性有較大影響。相關(guān)文獻(xiàn)表明，多糖的抗氧化活性與其單糖組成及各單糖的含量有著密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)美洲大蠊多糖對(duì)DPPH、OH、ABTS自由基具有較好的清除能力，HPLC測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)其水解液含有甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，摩爾比為17.0∶13.2∶9.6∶53.4∶21.8∶1.0∶4.6∶1.3；美洲大蠊多糖抗氧化作用可能與其單糖組成有關(guān)，而水解后的美洲大蠊多糖抗氧化活性能否保持或增加，有待實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。