杜國濤， 王 青， 趙偉偉， 張兆波， 孫 悅， 趙鵬程， 劉建中

滄州市人民醫(yī)院 1.肝膽外科；2.胃腸外科；3.檢驗科；4.超聲科，河北 滄州 061000

膽囊膽固醇結石屬于消化系統(tǒng)常見疾病，好發(fā)于成年女性，近年來發(fā)病率呈升高的趨勢。隨著病程延長，其有可能演變成膽囊癌及膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，危及患者生命安全[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可以通過肝雌激素受體(estrogen receptor，ER)誘發(fā)膽結石形成，但是目前臨床對于ERα或ERβ基因表達與膽囊膽固醇結石形成之間的關系少見報道[2]。本研究旨在探討ERα或ERβ基因表達與膽囊膽固醇結石形成之間的關系?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2015年10月至2018年6月于滄州市人民醫(yī)院接受手術治療的60例膽囊膽固醇結石患者納入B組，另選取60例因膽囊炎或肝血管瘤需要實施手術治療的患者納入A組。納入標準：(1)膽囊結石、膽囊炎、肝血管瘤患者的診斷標準參考人民衛(wèi)生出版社《外科學》第7版中的標準；(2)患者經(jīng)CT、超聲及磁共振胰膽管成像檢查確診；(3)患者年齡19～79歲。排除標準：(1)肝、膽道惡性腫瘤；(2)因寄生蟲病導致的結石疾病；(3)一般資料缺失，無法進行統(tǒng)計；(4)長期酗酒；(5)近2個月服用調血脂藥物史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 ERα mRNA和ERβ mRNA表達檢測方法 獲取肝組織總RNA并提取cDNA，采用美國GIBCO公司提供的Trizol試劑盒提取總RNA，在貝克曼D640U紫外分光光度計測定260 nm和280 nm下波長的A值，比值在1.6～1.8之間提示RNA純度高。在1%瓊脂糖凝膠電泳下鑒定RNA完整性，稀釋RNA 1 μg/μl，合成cDNA，在-80℃下保存，采用Primer Express軟件設計引物，上游引物序列：TCTTGGACAGGAACCAGGGA；下游引物序列：CGAGATGTAGCCAGCAGC。采用MedProbe公司提供的計算機系統(tǒng)開展測定，聚合酶鏈式反應產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確定特異性，反應條件：預變性95℃、15 min，變性95℃、10 s，退火59℃、20 s，進行40個循環(huán)，終末延伸72℃、32 s，結束后讀取Ct值，結果采用 2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.3 一般資料的收集及檢測 收集兩組患者的年齡、性別、體質量指數(shù)、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、瘦素、膽汁中總膽固醇及總膽汁酸含量。抽取患者空腹靜脈血3 ml，以2 000 r/min離心30 min后分離血清，采用日立7600型全自動生化分析儀對患者血脂瘦素、膽汁中總膽固醇及總膽汁酸含量進行測定，試劑盒為南京建成生物制品有限公司提供。用碳酸鹽包被緩沖液，將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/ml，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 ml，4℃過夜。次日用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被的反應孔中，置37℃孵育1 h。各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1 ml，37℃孵育0.5～1.0 h。洗滌加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 ml，37℃ 10～30 min。于各反應孔中加入2 mol/L硫酸0.05 ml終止反應后判讀結果。

2 結果

2.1 兩組患者肝組織中ERα mRNA和ERβ mRNA表達比較 B組患者肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達強度均顯著高于A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 兩組患者一般資料比較 B組患者血清甘油三酯、總膽固醇、瘦素、膽汁總膽固醇水平均高于A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 多因素Logistic回歸分析結果 患者的血清甘油三酯、瘦素、膽汁總膽固醇水平增高，肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達上調是發(fā)生膽囊膽固醇結石的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表1 兩組患者肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達比較

表2 兩組患者一般資料比較

表3 Logistic回歸分析

3 討論

膽石癥屬于臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，可繼發(fā)膽囊炎、膽管炎、胰腺炎，以及膽道腫瘤等多種疾患，危害患者身體健康，造成嚴重的社會經(jīng)濟負擔[3-4]。肝分泌過多的膽固醇是結石形成的主要病理基礎，膽固醇過飽和導致膽固醇晶體沉淀，并最終形成肉眼可見的結石[5-6]。膽固醇結石發(fā)生和發(fā)展受到基因、環(huán)境及遺傳因素相互調控，屬于多因素決定的復雜性疾病。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，種族差異和遺傳異質性在膽固醇結石發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用[7]。目前，血清甘油三酯、總膽固醇、瘦素、膽汁總膽固醇水平已被證實在促進膽固醇結石發(fā)展中具有重要的作用。膽汁酸是膽汁的主要組成成分，是膽固醇在肝中降解的代謝產(chǎn)物，膽汁酸不僅在膽固醇代謝及膽固醇的溶解中發(fā)揮重要作用，而且還影響食物脂類的消化、吸收。膽固醇的排泄受膽固醇與卵磷脂的相對比例的影響，當膽固醇與膽汁酸及卵磷脂的比值增高時，就會導致膽固醇過飽和，以結晶的形式析出，形成結石[8]。同時，膽結石患者體內(nèi)還存在血脂紊亂，高密度脂蛋白還會參與機體膽固醇逆轉運，將機體內(nèi)游離的膽固醇轉運至肝，優(yōu)先用于合成膽汁酸，其參與轉運的高密度脂蛋白膽固醇是膽汁內(nèi)膽固醇的主要來源，在一定條件下參與形成膽固醇結石[9-10]。

本研究分析了肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA的表達強度。ERα、ERβ可以發(fā)揮基因調節(jié)作用，調節(jié)下游靶基因。有研究發(fā)現(xiàn)，17β-雌二醇主要通過雌激素受體對靶基因轉錄調控，在膽汁膽固醇的生物合成中具有重要作用[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇結石發(fā)病同ERα上調有關，但是與ERβ無關，考慮是由于ERα和ERβ具有不同的轉錄激活結構域及組織分布特異性相關。本研究結果顯示，膽固醇結石發(fā)生與Erβ相關，原因可能為ERβ參與了ERα高表達人群膽固醇結石發(fā)生的遺傳性[12-13]。本研究中，B組患者肝組織中的ERα mRNA、ERβ mRNA表達強度顯著高于A組，提示在膽囊膽固醇結石患者中存在ERα mRNA、ERβ mRNA表達上調；B組患者的血清甘油三酯、總膽固醇、瘦素、膽汁總膽固醇水平均高于A組，提示在膽囊膽固醇結石患者中血脂表達異常；Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清甘油三酯、瘦素、膽汁總膽固醇水平增高、肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達上調是發(fā)生膽囊膽固醇結石的獨立危險因素，提示了血脂異常、肝組織中的ERα mRNA、ERβ mRNA表達升高會導致膽囊膽固醇結石高發(fā)。

綜上所述，肝組織中ERα mRNA、ERβ mRNA表達上調與膽囊膽固醇結石的形成密切相關。