劉 旭， 趙 巖， 韓 浩， 羅婭媛， 白燕鷗

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016；2.中國科學(xué)院金屬研究所沈陽材料科學(xué)國家研究中心，遼寧 沈陽 110016

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的急腹癥，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1]。有研究表明，AP病程中腸道微生態(tài)受到炎癥應(yīng)激的干擾，損傷腸屏障功能，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加、細(xì)菌移位及內(nèi)毒素血癥，誘發(fā)機(jī)體二次感染，造成全身炎癥反應(yīng)綜合征加重，多器官功能障礙，當(dāng)AP發(fā)展為重癥AP時(shí)甚至可導(dǎo)致患者死亡[2]。因此，針對AP患者腸道微生態(tài)的研究越來越受到關(guān)注。殼寡糖(chitooligosaccharide，COS)是殼聚糖或甲殼素通過化學(xué)或酶水解從蝦和蟹殼等天然物種中提取而成[3]，具有抗氧化、抗炎、抗菌和免疫調(diào)節(jié)特性[4]。多項(xiàng)研究表明，COS對腸道微生態(tài)紊亂有一定的治療作用[5-9]。本研究構(gòu)建AP大鼠模型并應(yīng)用COS進(jìn)行治療，旨在探討COS調(diào)節(jié)腸道菌群治療大鼠AP的療效?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取20只SPF級健康雄性6～8周SD大鼠為研究對象。大鼠體質(zhì)量(300±10)g，購自浙江省醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將大鼠常規(guī)喂食1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對照組與治療組，每組各10只。

1.2 AP動(dòng)物模型制備 大鼠于術(shù)前12 h禁食，自由飲水。腹腔注射戊巴比妥溶液(2 mg/100 g)麻醉。開腹后用3.5%牛黃膽酸鈉(1 ml/1 000 g)，以0.2 ml/min的速度沿胰膽管逆行注射，觀察5～10 min后關(guān)腹。注射24 h內(nèi)，觀察大鼠焦慮、煩躁等表現(xiàn)，詳細(xì)記錄。造模成功后，治療組給予10% COS灌胃，每8 h灌胃1次，每次5 ml，共進(jìn)行24 h。對照組給予等劑量生理鹽水灌胃。

1.3 樣本采集 血清采集：單手固定大鼠，大鼠眼眶靜脈采集血液，靜置30 min后放入離心機(jī)，3 000 r/min離心10 min，取上清液。糞便采集步驟：固定大鼠，將大鼠直立，擠壓大鼠腸道，促進(jìn)排便，用ep管收集糞便。研究結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，收集各組樣本的胰腺、腸組織，將組織放入10%福爾馬林溶液中固定，糞便置于凍存管后，立即放入-80℃保存，待進(jìn)一步檢測。

1.4 HE染色 兩組胰腺、腸組織固定24 h后，按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟、水合，將切片用二甲苯浸泡5 min，更換二甲苯后再浸泡5 min；無水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min，磷酸鹽緩沖液浸洗3次，每次3 min。浸入試劑盒染色。兩組組織在生物倒置顯微鏡下觀察。腸道組織病理評分以Chiu′s 腸組織損傷評分標(biāo)準(zhǔn)[10]為參考，胰腺組織病理評分以Schmidtt胰腺組織評分標(biāo)準(zhǔn)[11]為參考。

1.5 16S rDNA基因組的測序 參照糞便基因DNA提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)說明書抽提糞便菌群DNA，抽提所得DNA采用NanoDrop微量分光光度計(jì)檢測和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。將質(zhì)檢合格的基因組DNA純化后進(jìn)行兩輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。使用AMPure XP Beads 對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)(Life Technologies，美國)進(jìn)行定量，根據(jù)Novaseq 6000 的PE250 模式pooling 上機(jī)測序。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血液檢查結(jié)果比較 治療組血清淀粉酶下降幅度與血清脂肪酶下降幅度大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠血液檢查結(jié)果比較

2.2 兩組大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)彌漫性水腫，胰腺腺泡未見大量壞死細(xì)胞，有少量出血灶，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。治療組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)比較清晰，見區(qū)域性水腫，無出血灶和壞死細(xì)胞，少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.3 兩組大鼠腸道組織HE染色結(jié)果 對照組大鼠腸黏膜固有層嚴(yán)重水腫，絨毛頂端脫落，形態(tài)不規(guī)則，腸黏膜上皮細(xì)胞大量壞死，可見固有層裸露和絨毛脫落。治療組大鼠腸黏膜固有層水腫較對照組輕，絨毛形態(tài)不規(guī)則及上皮細(xì)胞壞死較對照組減輕。見圖2。

2.4 兩組大鼠糞便中腸道菌群比較 治療組veillonella菌屬、Ruminiclostridium菌屬、Prevotellaceae_UCG_001菌屬、Parabacteroides菌屬、Odoribacter菌屬、Muribaculum菌屬、Lachnospiraceae_UCG-006菌屬、Helicobacter菌屬顯著多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

AP病程中常因腸道供血減少等因素導(dǎo)致腸道微循環(huán)障礙[12]，損傷腸道黏膜屏障功能。AP還常伴有腸道蠕動(dòng)減少甚至消失，腸道正常的清道夫功能減弱，致病菌數(shù)量增加，誘發(fā)腸道菌群失調(diào)[13]。腸道黏膜屏障受損、腸道動(dòng)力減退、腸內(nèi)菌群失調(diào)及宿主免疫功能受損等可導(dǎo)致細(xì)菌移位的發(fā)生[14]，進(jìn)而引起胰腺或胰周組織壞死感染，加重病情，甚至危及生命。因此，針對AP腸道微生態(tài)的治療越來越受到臨床關(guān)注。

圖1 兩組大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果(a.對照組；b.治療組；HE×400)

圖2 兩組大鼠腸道組織HE染色結(jié)果(a.對照組；b.治療組；HE×400)

圖3 兩組大鼠造模24 h后腸道菌群比較

國際醫(yī)學(xué)營養(yǎng)食品學(xué)會(huì)將COS稱為除糖、蛋白質(zhì)、脂、維生素和無機(jī)鹽之后的“第六大生命要素”[15]。針對此類要素對腸道微生態(tài)的研究已逐漸開展[6-9]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過灌胃法給予COS后，構(gòu)建的大鼠AP動(dòng)物模型血清淀粉酶、脂肪酶恢復(fù)更快，胰腺組織的炎癥表現(xiàn)更輕，證明了其對AP的治療作用；進(jìn)一步針對大鼠腸道的檢查發(fā)現(xiàn)，COS治療組大鼠的腸道黏膜的炎癥表現(xiàn)優(yōu)于對照組；糞便菌群研究顯示，COS治療24 h后大鼠糞便中的多個(gè)菌屬數(shù)量均明顯多于對照組。因此，筆者分析COS治療大鼠AP的機(jī)制可能是應(yīng)用COS增加了AP大鼠腸道菌群的多樣性和豐富性，更好地調(diào)控了腸道菌群的平衡，進(jìn)而降低了有害菌的數(shù)量，保護(hù)了腸道黏膜屏障。

綜上所述，COS灌胃對大鼠AP有一定的治療作用，且可能與其通過調(diào)節(jié)腸道菌群、保護(hù)腸黏膜屏障作用有關(guān)。但由于腸道菌群的綱、門、科、屬、種分類繁多，本研究僅從菌屬層面探討了兩組AP大鼠的腸道微生態(tài)變化。因此，仍需要通過進(jìn)一步更全面、深入的研究予以證實(shí)。