劉曉英,沈鑫,張靜,榮晅,鄧卓
(陜西省人民醫(yī)院 婦科,陜西 西安710068)
最常見的宮頸癌類型是鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC),其由低級別鱗狀上皮內(nèi)病變和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變形成的。宮頸癌的主要危險因素是乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染[1]。有研究發(fā)現(xiàn),膜離子通道在惡性腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用,例如,氯離子通道可促進腫瘤細胞的侵襲,以及原發(fā)性腦腫瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腦轉(zhuǎn)移[2]。氯離子通道蛋白-3(CIC-3)是電壓門控性氯離子通道家族的成員,與惡性腫瘤細胞行為的調(diào)控有關(guān),如增殖、遷移、侵襲和凋亡[3-5],提示CIC-3 可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵啟動子。有研究報道,CIC-3 在異位子宮內(nèi)膜細胞的遷移和侵襲中起著關(guān)鍵作用[3],并且可能是腫瘤擴散的預后生物標志物[6]。CIC-3 的異常表達可能導致各種病理狀況,最近一些研究表明,CIC-3基因表達的變化可能會增加子宮內(nèi)膜癌、鼻咽癌、乳腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌癥的發(fā)生風險[7-8]。并且,CIC-3 通過調(diào)控多種分子信號途徑來促進惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。然而,目前CIC-3 在宮頸鱗癌中的表達模式仍有待進一步揭示,并且尚不清楚靶向調(diào)控CIC-3 的表達是否可以調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。因此,本研究檢測CIC-3 在宮頸鱗癌中的表達及其與預后的相關(guān)性,并且通過上調(diào)或下調(diào)CIC-3的表達進一步研究對宮頸鱗癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響,旨在為宮頸癌的治療提供新的分子靶標。
選取體重為20~25 g、7 周齡左右的雄性BALB/c-nu/nu 裸小鼠[動物許可證號:SYXK(陜)2016-006],由陜西省人民醫(yī)院提供。人宮頸鱗癌細胞系SiHa 和人宮頸上皮永生化細胞系H8 購自美國ATCC 公司,胎牛血清購自美國HyClone 公司,DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司,Trizol 試劑購自日本TaKaRa 公司,M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Life Technologies 公司,AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司,CIC-3、PI3K、total-AKT 和p-AKT 抗體購自英國Abcam 公司,3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自北京索萊寶科技有限公司,RIPA 裂解液購自德國Roche 公司,BCA 分析試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,聚偏二氟乙烯膜、Transwells 美國Millipore 公司,Bcl-2、p21 和β-actin 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司,HRP 標記的二抗、ECL 化學發(fā)光系統(tǒng)、CCK-8、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所,Matrigel 購自美國BD Biosciences公司。
1.2.1 標本收集和細胞培養(yǎng)選取2016年9月—2018年9月在陜西省人民醫(yī)院就診的宮頸鱗癌患者60 例。收集患者宮頸癌組織、配對癌旁組織及臨床基線資料。組織收集前,患者未接受任何新輔助化療或放療。將SiHa 和H8 細胞加入含有10%胎牛血清(FBS)、100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中,在含5% CO2的濕潤環(huán)境中37℃條件下培養(yǎng)。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準,患者簽署知情同意書后再收集病理標本進行收集。
1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)使用Trizol 試劑提取組織和細胞中的總RNA,并使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 在CFX96Touch 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)系統(tǒng)進行,引物如下:CIC-3正向引物:5'-TTGCCTCTCACAACAGCACGAAATCAATC-3',長度 27bp;反向引物:5'-ATTCTCTCCAGCTAAACTTATTTCAAGAA-3', 長 度29 bp;GAPDH 作為內(nèi)部參考,正向引物:5'-GAGTCTAAGTCGGCATCGGGTCCAAAGATT-3', 長度 30bp; 反向引物:5'-GATTCTCAGCTGGCCAAGAGTAGTCCTTAG-3', 長度30 bp。反應(yīng)條件:95℃預變性5 min,95℃變性10 s,60℃退火10 s,72℃拉伸30 s,共40 個循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計算相對表達量。
1.2.3 免疫組織化學法對石蠟包埋的宮頸組織樣品進行常規(guī)的脫蠟和再水化。在92 ~98℃、10 mmol 檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)中進行10 min的抗原回收。然后將樣品經(jīng)0.3% H2O2處理15 min。正常山羊血清孵育20 min,PBS 洗滌后,將樣品在小鼠抗CIC-3 抗體(1∶500 稀釋)中4℃過夜孵育。將切片用PBS 洗滌,并在生物素化的二抗中孵育60 min(1∶1 000 稀釋)。然后經(jīng)DAB 處理5 min,用蘇木精復染。陽性染色為細胞膜或細胞質(zhì)中的棕色染色。將切片在倒置顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析。根據(jù)染色強度和陽性細胞百分比計算CIC-3 的染色評分。染色強度分為4 個等級:0~3 分依次代表無染色、弱染色、中等染色和強染色。陽性細胞百分比評分分為4 個等級:0~3 分依次代表<10%、10%~25%、25%~50%和>50%。
1.2.4 Western blotting將宮頸組織樣本和細胞在含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中裂解,使用BCA 試劑盒評估蛋白相對表達量。按照試劑盒說明書,在8% SDS-PAGE 凝膠中分離蛋白質(zhì),并將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。在室溫下用5%脫脂奶將膜封閉2 h。隨后,將膜與CIC-3(1∶1 000 稀釋)、PI3K (1∶1 000 稀 釋)、total-AKT (1∶3 000 稀釋)、p-AKT(1∶3 000 稀釋)、Bcl-2(1∶500 稀釋)、p21(1∶2 000 稀釋)和β-actin 一抗(1∶1 000 稀釋) 在4℃環(huán)境下孵育過夜。然后將膜在HRP 標記的二抗(1∶500 稀釋)中室溫孵育2 h。通過使用ECL 系統(tǒng)進行顯影,以β-actin 作為內(nèi)參蛋白。
1.2.5 siRNA轉(zhuǎn)染靶向CIC-3 的siRNA(si-CIC-3)和對照siRNA(si-NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成, si-CIC-3 正向序列:UAUGCGCAUUUUCAACUCAGAG,長度22 bp;反向序列:CUACGGAAGUUGAGAAUGACCAUU,長度 24 bp; si-NC 正向序列 :UCGACCAGGGGUGUACGACGAUUA,長度24 bp;反向序列: UUUCACGAAGUGAGCAGCGGCUCC,長度24 bp。將SiHa 細胞分為對照組、si-NC 組和si-CIC-3 組。對照組不進行轉(zhuǎn)染;使用Lipofectamine 2000 瞬時轉(zhuǎn)染si-CIC-3 (si-CIC-3組)或si-NC(si-NC 組)SiHa 細胞。
1.2.6 CCK-8法使用CCK-8 對細胞增殖進行評估。將5×103個SiHa 細胞接種到96 孔板中,每孔加入10 μl CCK-8 溶液,分別培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h后使用BIO-TEK 酶標儀檢測450 nm 波長處的光密度值(OD)。
1.2.7 流式細胞術(shù)使用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒通過流式細胞術(shù)評估細胞凋亡。將1×105個SiHa 細胞用PBS 洗滌3 次后,將細胞加入含10 μl Annexin V-FITC 和5 μl 碘化丙啶(PI)的500 μl 結(jié)合緩沖液,在黑暗環(huán)境中孵育20 min。通過BD FACSCalibur 流式細胞儀檢測細胞凋亡。
1.2.8 傷口愈合實驗將按1×105個/孔SiHa 細胞接種到6 孔板中,達到90%融合時,用移液槍在細胞表面劃1 個劃痕。用PBS 洗滌細胞3 次,將細胞在新鮮培養(yǎng)基中孵育24 h,在顯微鏡下以100 倍放大倍數(shù)觀察并拍照傷口愈合情況。
1.2.9 細胞遷移和侵襲測定在孔徑為8 μm的24個孔Transwell 中進行遷移實驗。將2×105個SiHa 細胞加入含有1% FBS 的200 μl DMEM 中,并添加到上室,將含有10% FBS 的600 μl DMEM 添加到下室。孵育24 h 后,除去上室中的未遷移細胞,用4%多聚甲醛固定并用Giemsa 染色,然后計數(shù)遷移細胞。將上室中細胞預先用Matrigel 涂覆后用于考察細胞的侵襲能力。
1.2.10 體內(nèi)腫瘤異種移植模型將小鼠飼養(yǎng)在25℃、55%相對濕度的環(huán)境中,自由進食。分別將5×106個si-CIC-3 或si-NC 轉(zhuǎn)染的SiHa 細胞注入裸鼠背部,復制10 個腫瘤異種移植模型。每隔1 周監(jiān)測1 次腫瘤生長,共4 周,腫瘤體積=0.5×短徑2×長徑。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較用t檢驗、方差分析或重復測量設(shè)計的方差分析,進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
免疫組織化學染色結(jié)果顯示,CIC-3 蛋白主要表達于子宮頸鱗狀上皮細胞胞質(zhì)區(qū)。宮頸鱗癌組織和癌旁組織中CIC-3 的陽性染色評分分別為(7.05±0.56)分和(1.13±0.08)分,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.004,P=0.001),癌組織較癌旁組織高。宮頸鱗癌組織和癌旁組織中CIC-3 mRNA 相對表達量分別為(5.45±0.42)和(1.00±0.03),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=11.853,P=0.000),癌組織較癌旁組織高。宮頸鱗癌組織和癌旁組織中CIC-3/β-actin 相對表達量分別為(0.89±0.07)和(0.24±0.03),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.986,P=0.001),癌組織較癌旁組織高(見圖1、2)。
圖1 CIC-3在宮頸鱗癌組織和細胞系中的表達
人宮頸鱗癌細胞系SiHa 細胞的CIC-3 mRNA 相對表達量為(3.27±0.39),人正常宮頸上皮H8 細胞為(1.00±0.07),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=10.537,P=0.001),SiHa 細胞較H8 細胞高。人宮頸鱗癌細胞系SiHa 細胞的CIC-3 蛋白相對表達量為(0.56±0.05),人正常宮頸上皮H8 細胞為(0.31±0.02),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=13.245,P=0.000), SiHa 細胞較H8細胞高(見圖3)。
不同年齡患者CIC-3 高表達率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),不同腫瘤直徑、TNM 分期和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CIC-3 高表達率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
表1 不同因素的宮頸鱗癌患者CIC-3高表達率比較例(%)
對照組SiHa 細胞中CIC-3 mRNA 相對表達量為(1.00±0.05),si-NC 組為(0.97±0.05),si-CIC-3組為(0.17±0.01),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=335.630,P=0.000)。對照組SiHa 細胞中CIC-3 蛋白相對表達量為(0.87±0.04),si-NC 組為(0.91±0.05),si-CIC-3 組為(0.21±0.01),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=274.740,P=0.000),轉(zhuǎn)染靶向CIC-3 的siRNA 可下調(diào)SiHa 細胞中CIC-3 mRNA 和CIC-3 蛋白相對表達量(見圖4)。對不同時間的CCK-8 實驗數(shù)據(jù)進行重復測量數(shù)據(jù)的方差分析,球形檢驗的P值為0.154,滿足球形分布假設(shè),說明重復測量數(shù)據(jù)間無相關(guān)性。對照組SiHa細胞在培養(yǎng)48 h 后OD 值為(0.31±0.02),si-NC 組為(0.32±0.03),si-CIC-3 組為(0.22±0.01),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=98.540,P=0.000);對照組SiHa 細胞在培養(yǎng)72 h 后OD 值為(0.61±0.04),si-NC 組為(0.64±0.05),si-CIC-3組為(0.41±0.03),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=142.700,P=0.000),下調(diào)CIC-3 能抑制SiHa細胞的增殖(見圖5)。
圖4 轉(zhuǎn)染CIC-3 siRNA下調(diào)SIHA細胞中CIC-3的蛋白表達
圖5 下調(diào)CIC-3對SIHA細胞增殖的影響
流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,對照組SiHa 細胞的凋亡率為(2.31±0.12)%,si-NC 組為(2.47±0.13)%,si-CIC-3 組為(13.25±0.70)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=255.650,P=0.000),下調(diào)CIC-3 可促進SiHa 細胞的凋亡(見圖6)。傷口愈合實驗和Transwell 實驗顯示,對照組SiHa 細胞的傷口愈合率為(42.43±2.23)%,si-NC 組為(44.21±2.33)%,si-CIC-3 組為(21.08±1.11)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=61.220,P=0.000);對照組遷移細胞數(shù)為(104.2±5.48)個,si-NC 組為(110.5±5.82) 個, si-CIC-3 組為(56.4±2.97)個,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=315.580,P=0.000),對照組侵襲細胞數(shù)為(92.3±4.86),si-NC 組 為(90.4±4.76),si-CIC-3組為(44.5±2.34),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=178.430,P=0.000),下調(diào)CIC-3可抑制SiHa細胞的遷移和侵襲能力(見圖7)。
圖6 SIHA細胞的流式細胞圖
圖7 下調(diào)CIC-3對SIHA細胞遷移和侵襲的影響
在體外腫瘤異種移植實驗中,對不同時間的腫瘤體積進行重復測量數(shù)據(jù)的分析,球形檢驗的P值為0.334,滿足球形分布假設(shè),說明重復測量數(shù)據(jù)間不存在相關(guān)性。si-NC 組在14 d、21 d 及28 d 的腫瘤體積分別為(49.12±3.12)mm3、(71.88±5.32)mm3和(102.79±7.64)mm3,si-CIC-3組分別為(33.26±1.73)mm3、(45.04±3.28)mm3和(63.96±4.85)mm3,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.914、10.001 和12.737,P=0.004、0.001 和0.000),si-CIC-3 組較si-NC 組低。
各組SIHA 細胞中的PI3K、p-AKT、Bcl-2 和p21蛋白相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=173.02、166.20、141.39 和159.91,均P=0.000),si-NC 組和si-CIC-3 組下調(diào)CIC-3 可抑制PI3K、p-AKT 和Bcl-2 的蛋白表達,但促進p21 的表達(見表2和圖8)。
表2 下調(diào)CIC-3對SIHA細胞中PI3K-AKT信號通路及下游分子的影響 (±s)
表2 下調(diào)CIC-3對SIHA細胞中PI3K-AKT信號通路及下游分子的影響 (±s)
注:①與si-CIC-3組比較,P <0.05。
組別p21 PI3K p-AKT total-AKT Bcl-2對照組si-NC組si-CIC-3組0.22±0.01①0.25±0.01①0.64±0.04 0.56±0.03①0.54±0.03①0.13±0.01 0.62±0.03①0.64±0.04①0.21±0.01 0.98±0.05 0.97±0.06 1.03±0.07 0.72±0.04①0.71±0.04①0.31±0.02
圖8 SIHA細胞中PI3K-AKT信號通路及下游分子的蛋白表達
CIC-3 在多種細胞功能中起著重要作用,并且與多種腫瘤進展有關(guān)。WANG 等[4]發(fā)現(xiàn)CIC-3 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達,與組織學分級呈正相關(guān)[4]。CIC-3 表達較低的腦膠質(zhì)瘤患者生存時間較長,而CIC-3 表達較高的腦膠質(zhì)瘤患者的生存時間較短[9]。XU 等[6]還報道細胞質(zhì)CIC-3 過表達與宮頸癌的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),在細胞質(zhì)中CIC-3 表達水平較高的患者生存率較差。然而,目前尚缺乏CIC-3 在宮頸癌進展中的作用研究。本研究分析CIC-3 在人宮頸鱗癌中的表達水平及其與預后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)CIC-3 在人宮頸鱗癌組織和SiHa 細胞系中被上調(diào),并且與患者的腫瘤大小、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),在腫瘤直徑>4 cm、TNM 分期為Ⅲ期、Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中,CIC-3 主要表現(xiàn)為高表達。因此,CIC-3 高表達是宮頸鱗癌惡化的生物標志物。
為進一步揭示CIC-3 在宮頸鱗癌發(fā)生、進展中的作用,本研究通過轉(zhuǎn)染靶向CIC-3 的siRNA 來敲除SiHa 細胞系中CIC-3 的表達。結(jié)果顯示,下調(diào)CIC-3 可抑制宮頸鱗癌細胞的生長,促進細胞凋亡。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白[10-11],p21 是一種促凋亡蛋白[12]。本研究也顯示,下調(diào)CIC-3 可抑制Bcl-2的表達,促進p21 的表達,說明CIC-3 對宮頸鱗癌細胞凋亡的調(diào)控作用部分通過Bcl-2 和p21 介導。此外,在體內(nèi)實驗中,本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)CIC-3 可抑制腫瘤異種移植模型裸鼠的腫瘤生長。因此,上述結(jié)果提示靶向調(diào)控CIC-3 的表達可通過影響宮頸鱗癌的細胞生長來干預腫瘤進展。
腫瘤細胞的遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要過程[13-15]。有研究表明,CIC-3 參與細胞體積變化和氯離子電流的調(diào)節(jié),該電流與癌細胞的細胞遷移和侵襲呈正相關(guān)[16-17]。另外,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞通過改變CIC-3 離子通道的活性來改變侵襲性。CIC-3在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞血漿膜上高表達,其活性受Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ磷酸化的調(diào)控[18]。在本研究中,下調(diào)可CIC-3 抑制宮頸鱗癌細胞的遷移和侵襲。因此,CIC-3 在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。
PI3K-Akt 信號通路是一種經(jīng)典的細胞存活通路,PI3K-Akt 的激活可抑制細胞凋亡,促進增殖[19-20]。有研究報道,PI3K-Akt 信號通路及其下游信號分子在乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中異常激活,并且直接調(diào)控細胞的生長和侵襲[21-22]。雖然PI3K-AKT 信號通路也調(diào)節(jié)宮頸癌細胞功能[23],但是目前尚不清楚CIC-3基因是否在宮頸鱗癌中調(diào)節(jié)PI3K-AKT 信號通路。本研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)CIC-3 可抑制宮頸鱗癌細胞中PI3K-AKT 信號通路的活性。另外,Bcl2 和p21 均是PI3K-AKT 信號通路的下游分子[24]。因此,本研究表明通過抑制PI3K-AKT 信號通路可抑制CIC-3 對宮頸鱗癌細胞的促凋亡作用。
綜上所述,本研究表明CIC-3 在宮頸鱗癌中高表達,下調(diào)CIC-3 可抑制宮頸鱗癌的生長和轉(zhuǎn)移。CIC-3 對宮頸鱗癌細胞凋亡的調(diào)控作用部分通過PI3K-AKT 信號通路介導。因此,靶向CIC-3 可能是診斷和治療宮頸鱗癌的新策略。