顏飛翔 朱 丹 牛廣財(cái) 魏文毅 王思溥

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

秋香梨是黑龍江省農(nóng)科院園藝所培育而成的秋子梨(PyrusussuriensisMaxim.)品種，果實(shí)圓形，肉質(zhì)細(xì)膩多汁，可溶性固形物含量高，酸甜適口，是加工梨汁的優(yōu)良品種[1]。梨功效在中國(guó)歷代本草學(xué)中均有記載[2]。近年來，因梨中含有多酚、類黃酮、綠原酸等生理活性物質(zhì)，其具有較好的抗氧化活性[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[4]也證實(shí)了梨的清熱鎮(zhèn)靜和降低血壓的作用。目前梨規(guī)?；a(chǎn)的加工產(chǎn)品主要以果汁、梨膏、罐頭類為主，而其他梨酒、梨醋等產(chǎn)品較少。

果醋一般是以水果為原料，經(jīng)酶解處理、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵而成的一種營(yíng)養(yǎng)豐富的酸性調(diào)味品，富含維生素、氨基酸和碳水化合物，能夠補(bǔ)充人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5]。果醋可以改善肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌癥等[6]。目前，中國(guó)已有學(xué)者對(duì)庫爾勒香梨[7]、雪花梨[8]、皇冠梨[9]等梨醋的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，但有關(guān)秋香梨果醋的發(fā)酵工藝及抗氧化能力評(píng)價(jià)尚未見報(bào)道。

研究擬采用液態(tài)發(fā)酵方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化滬釀1.01醋酸菌發(fā)酵秋香梨果醋的工藝條件，并通過1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基清除能力、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力和Fe3+還原能力來評(píng)價(jià)秋香梨果醋的抗氧化能力，為秋香梨果醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

秋香梨酒：酸質(zhì)量濃度為1.5 g/L，酒精度為12%vol(20 ℃)，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院；

菌種：滬釀1.01醋酸桿菌，黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保存；

DPPH：純度>97%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

ABTS：純度>99%，美國(guó)Sigma公司；

其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫震蕩培養(yǎng)箱：HZXQ-R型，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

震蕩培養(yǎng)箱：HZQ-F160型，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

全溫震蕩培養(yǎng)箱：HZQD-D型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

電子分析天平：BN2484型，上海民橋精密儀器有限公司；

立式壓力滅菌鍋：LDZX-40Ⅱ型，上海申安醫(yī)療器械廠；

超凈工作臺(tái)：BCN-1360型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

pH計(jì)：SG2型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

過濾機(jī)：EYCKW-1型，溫州市東頂機(jī)械制造有限公司；

冰箱：BCD-235YH型，青島海爾股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 秋香梨果醋加工工藝

醋酸菌

↓

秋香梨酒→酒度調(diào)整→接種→醋酸發(fā)酵→陳釀→澄清過濾→殺菌→成品

操作要點(diǎn)：

(1) 酒度調(diào)整：參照董玉新[10]的方法，修改如下：取500 mL酒精度為12%vol的秋香梨原酒，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)，用純凈水將酒精度調(diào)整為7%vol(20 ℃)。

(2) 醋酸菌活化：向500 mL三角瓶中加入葡萄糖1 g，酵母膏1 g，蒸餾水100 mL，真空度0.1 MPa下滅菌30 min，接入醋酸菌，30 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，得活化好的醋酸菌，菌數(shù)達(dá)5×106CFU/mL，備用。

(3) 接種：取500 mL梨酒于1 000 mL三角瓶中，在超凈工作臺(tái)上接入不同接種量的醋酸菌液。

(4) 醋酸發(fā)酵：將接種后的三角瓶放入恒溫震蕩箱中，轉(zhuǎn)速為130 r/min，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和初始pH等條件下進(jìn)行發(fā)酵。

(5) 陳釀：秋香梨果醋發(fā)酵液于室溫陳釀30 d。

(6) 澄清過濾：陳釀結(jié)束后除去大部分菌株代謝物和部分沉淀后，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的殼聚糖，處理1 h，過濾。

(7) 殺菌：采用巴氏殺菌，75 ℃殺菌20 min。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

(1) 接種量對(duì)秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d，考察接種量(4%，6%，8%，10%，12%)對(duì)總酸含量的影響。

(2) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發(fā)酵溫度31 ℃，接種量10%，考察發(fā)酵時(shí)間(1，2，3，4，5，6，7 d)對(duì)總酸含量的影響。

(3) 發(fā)酵溫度對(duì)秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發(fā)酵時(shí)間7 d，接種量10%，考察發(fā)酵溫度(25，28，31，34，37 ℃)對(duì)總酸含量的影響。

(4) 初始pH對(duì)秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響：固定酒精度7%vol，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d，接種量10%，考察初始pH(3.2，3.8，4.4，5.0，5.6)對(duì)總酸含量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定初始酒精度為7%vol，選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和初始pH為自變量，以總酸含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化秋香梨果醋醋酸發(fā)酵工藝。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

(1) 酒精度：蒸餾法。

(2) 總酸含量：常規(guī)酸堿滴定法(以醋酸計(jì))。

(3) DPPH自由基清除率：根據(jù)樊秋元等[11]的方法。

(4) ABST自由基清除率：根據(jù)杜朝東等[12]的方法。

(5) Fe3+還原力：根據(jù)樊秋元等[13]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 8.5軟件繪圖，響應(yīng)面試驗(yàn)通過Design-Expert 8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1(a)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨接種量的增加先升高后降低，當(dāng)接種量為10%時(shí)，總酸含量最高達(dá)53.31 g/L；當(dāng)接種量>10%時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多消耗在菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖上，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)菌體過早老化，生成的醋酸量減少，影響發(fā)酵效果[14]。因此，選擇秋香梨果醋發(fā)酵的醋酸菌最佳接種量為10%。由圖1(b)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后略降低，發(fā)酵第6天，發(fā)酵液的總酸含量達(dá)到峰值，繼續(xù)發(fā)酵則發(fā)酵液中的總酸含量呈下降趨勢(shì)。這可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗，當(dāng)發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(尤其是酒精)缺乏時(shí)，醋酸菌會(huì)分解醋酸，出現(xiàn)過氧化現(xiàn)象，酸度降低[15]。因此，選擇6 d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖1 各因素對(duì)秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響

由圖1(c)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨發(fā)酵溫度的升高先上升后下降，當(dāng)發(fā)酵溫度<31 ℃時(shí)，醋酸菌的代謝活動(dòng)減弱，總酸含量較低；隨著發(fā)酵溫度的升高，31 ℃時(shí)秋香梨果醋的總酸質(zhì)量濃度最高值達(dá)51.98 g/L；當(dāng)溫度>31 ℃時(shí)，高溫會(huì)抑制醋酸菌中相關(guān)酶的活性，產(chǎn)酸量降低[16]；因此，31 ℃為最佳發(fā)酵溫度。由圖1(d)可知，隨著pH值的增加，總酸含量先升高后急速下降。當(dāng)初始pH為4.4時(shí)，發(fā)酵液中總酸質(zhì)量濃度達(dá)最高52.11 g/L。當(dāng)初始pH>4.4時(shí)，醋酸菌細(xì)胞的生理功能受影響，秋香梨果醋的酸度急劇降低，同時(shí)影響產(chǎn)品品質(zhì)[17]。因此，最佳初始pH選擇4.4。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和初始pH為自變量，以總酸含量為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素及水平編碼見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸方程的建立及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，經(jīng)回歸擬合后得到二次回歸方程：

表1 因素與水平編碼表

Y=52.76-2.96X1+0.39X2-0.41X3+0.78X4-

(1)

2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)曲面的陡度及等高線與坐標(biāo)軸交點(diǎn)個(gè)數(shù)能在一定程度上反映試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值影響的大小。若曲面坡度平緩，則因素值的變化對(duì)響應(yīng)值影響較??；反之，則影響較大。等高線與坐標(biāo)軸交點(diǎn)個(gè)數(shù)越多，則對(duì)響應(yīng)值影響越大；反之，則較小。等高線的形狀越扁平也說明交互作用越強(qiáng)。對(duì)秋香梨果醋中總酸含量影響顯著的交互項(xiàng)有X1X2和X1X4。其響應(yīng)面圖和等高線圖如圖2所示。由圖2可知，響應(yīng)面圖非常陡峭，等高線圖也呈現(xiàn)較扁平的橢圓形，并且X1對(duì)總酸含量的影響大于X2和X4，與方差分析結(jié)果一致。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 利用已建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件為醋酸菌接種量9.45%，發(fā)酵時(shí)間5.90 d，發(fā)酵溫度31.15 ℃，初始pH 4.49?？紤]實(shí)際操作，修正工藝條件為醋酸菌接種量9.4%，發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度31 ℃，初始pH 4.5，此條件下的總酸含量為54.45 g/L，與理論預(yù)測(cè)值53.25 g/L誤差較小，說明該模型能較好地預(yù)測(cè)秋香梨果醋的醋酸發(fā)酵工藝。

表3 回歸模型的方差分析?

2.3 秋香梨果醋的抗氧化能力

由表4可知，發(fā)酵后秋香梨果醋的抗氧化能力顯著提高(P<0.05)，ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和還原力分別較發(fā)酵前提高了23.65%，21.17%，30.23%，與廖良坤等[18-19]的結(jié)果一致。Merve等[20]研究發(fā)現(xiàn)，酸櫻桃醋的抗氧化能力與其功能性化合物如沒食子酸和綠原酸有關(guān)；陳怡等[21]研究表明，釀造醋的總多酚、總黃酮含量與總抗氧化能力以及超氧自由基、DPPH自由基和羥基自由基清除率均極顯著相關(guān)(P<0.01)；孫璐宏等[22]研究表明，柿果醋的總抗氧化能力與總酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。因此，發(fā)酵后秋香梨果醋的抗氧化性能顯著提高，可能與果醋發(fā)酵過程中醋酸含量大幅上升有關(guān)。同時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，梨醋中的醇類和醛類化合物會(huì)氧化成酸類化合物，如乙酸和己酸[23-24]。此外，還與發(fā)酵帶來的一些微生物其他發(fā)酵產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，如轉(zhuǎn)化黃酮和生物堿類物質(zhì)，以及發(fā)酵過程中多種有機(jī)酸的相互作用有關(guān)。

3 結(jié)論

秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為醋酸菌接種量9.4%，發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度31 ℃，初始pH 4.5，此條件下秋香梨果醋總酸含量為54.45 g/L。秋香梨酒經(jīng)醋酸菌發(fā)酵后，表現(xiàn)出了良好的體外抗氧化能力，其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和Fe3+還原能力分別提高了21.17%，23.65%，30.23%。后續(xù)將對(duì)該果醋發(fā)酵過程中品質(zhì)及發(fā)酵前后風(fēng)味成分變化進(jìn)行分析。

圖2 各因素對(duì)總酸質(zhì)量濃度的交互作用

表4 秋香梨果醋的抗氧化能力?