徐夢豪 梁 艷 姚艷艷 朱紀海 趙祥忠

(1. 齊魯工業(yè)大學〔山東省科學院〕食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；2. 威海長青海洋科技股份有限公司，山東 威海 264300；3. 山東中碩海洋科技有限公司，山東 日照 276800)

冰島刺參(Cucumariafrondosa)，屬棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)枝手目(Dendrochirota)瓜參科(Cucumariidae)[1]，主要分布于冰島、加拿大、俄羅斯、挪威等北大西洋海域。其富含蛋白質(zhì)[2]、維生素、多糖[3-4]、三萜糖苷[5]和脂類等多種活性成分，具有抗癌[6]、抗血栓[7]、抗炎[8]、抗高血糖[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等功能。參腸及其性腺組織是冰島刺參內(nèi)臟中的主要器官，被統(tǒng)稱為海參花[11]，其食用歷史悠久[12]，是珍貴的水產(chǎn)制品之一。冰島刺參內(nèi)臟中脂類物質(zhì)豐富，包含糖脂、磷脂、胡蘿卜素、脂溶性維生素以及脂肪酸等脂溶性成分。多不飽和脂肪酸(PUFA)約占內(nèi)臟中脂類物質(zhì)的44%，且以EPA為主[13-15]。冰島刺參在初級加工過程中會留有大量內(nèi)臟，小部分被制作成干品海參花，但大部分作為飼料進行處理，造成了資源浪費。

亞臨界流體萃取技術是一種在飽和壓力下，亞臨界狀態(tài)的萃取溶劑與物料在系統(tǒng)內(nèi)相接觸，并經(jīng)浸提、蒸發(fā)脫溶、壓縮、冷凝回收等過程，從天然產(chǎn)物中萃取目標組分的一種分離技術，已被廣泛應用于各類天然產(chǎn)物的萃取與分離[16]，而采用亞臨界萃取技術萃取冰島刺參內(nèi)臟油脂的工藝尚未見報道。試驗擬根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗原理分析方法，優(yōu)化并建立一種萃取冰島刺參內(nèi)臟油脂的新工藝，并與不同萃取方法的油脂進行理化指標與GC-MS分析比較，為開發(fā)全新冰島刺參衍生產(chǎn)品以及提高冰島刺參內(nèi)臟附加值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

冰島刺參內(nèi)臟(含性腺、參腸、胃囊)：榮成石島集團有限公司；

正己烷：色譜級，天津科密歐化學試劑有限公司；

甲醇：色譜級，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

硫酸：分析純，煙臺遠東精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

真空冷凍干燥試驗機：LG0.2型，新陽速凍設備制造有限公司；

亞臨界流體萃取實驗室成套設備：CBE-30+5L型，河南省亞臨界生物技術有限公司；

色譜柱：TR-FAME型，100 m×0.25 mm×0.20 μm，美國賽默飛公司；

電子天平：HZT-A2000型，福州華志科學儀器有限公司；

高速中藥粉碎機：HX-200型，浙江省永康市溪岸五金藥具廠；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Aglient 7890B GC-5977B MSD型，美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗流程及操作要點

冰島刺參內(nèi)臟清洗→控水→稱量→凍干→稱量→粉碎過篩→裝袋→萃取→GC/MS分析

(1) 樣品前處理：將冰島刺參內(nèi)臟洗凈后進行凍干。冷阱溫度-35 ℃，真空度10 Pa，冷凍干燥時間48 h，粉碎過40目篩，陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 萃取條件：按單因素及響應面優(yōu)化后萃取參數(shù)進行。

(3) 油脂甲酯化：根據(jù)文獻[17]修改如下：取1 mL油脂樣品于具塞試管中，加入5 mL 5%硫酸—甲醇溶液，75 ℃水浴甲酯化2 h，冷卻，加入2.5 mL正己烷充分振蕩，靜置分層，取上層清液于玻璃試管中，加入適量無水硫酸鈉干燥，收集干燥樣品，上機檢測。按式(1)計算萃取率。

(1)

式中：

ω——油脂萃取率，%；

M1——油脂質(zhì)量，g；

M2——樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 油脂理化指標測定

(1) 皂化值：根據(jù)GB/T 5534—1995。

(2) 過氧化值：根據(jù)GB 5009.227—2016。

(3) 碘值：根據(jù)GB/T 5532—2008。

(4) 水分及揮發(fā)物：根據(jù)GB 5009.236—2016。

1.3.3 氣相色譜—質(zhì)譜分析條件 根據(jù)廉桂芳[17]的方法并修改。色譜條件：進樣量1 μL；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：60 ℃保持2 min，以30 ℃/min升溫至120 ℃，再以2 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。質(zhì)譜條件：EI離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu。

1.3.4 定性分析 樣品經(jīng)GC-MS檢測后，利用其所配置的NIST 14標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對樣品進行自動檢索。

1.3.5 定量分析 按照峰面積歸一化法計算各方法所得海參內(nèi)臟油脂中EPA的相對含量。

1.4 響應面法優(yōu)化亞臨界萃取內(nèi)臟油脂工藝

1.4.1 單因素試驗

(1) 料液比：固定萃取壓強0.2 MPa，萃取次數(shù)3次，萃取時間30 min，萃取溫度40 ℃，考察料液比(m冰島刺參∶V萃取液)[1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)]對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

(2) 萃取壓強：固定料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶2 (g/mL)，萃取次數(shù)3次，萃取時間30 min，萃取溫度40 ℃，考察萃取壓強(0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 MPa)對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

(3) 萃取次數(shù)：固定料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶2 (g/mL)，萃取壓強0.2 MPa，萃取時間30 min，萃取溫度40 ℃，考察萃取次數(shù)(1，2，3，4，5)對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

(4) 萃取時間：固定料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶2 (g/mL)，萃取壓強0.2 MPa，萃取次數(shù)3次，萃取溫度40 ℃，考察萃取時間(20，30，40，50，60 min)對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

(5) 萃取溫度：固定料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶2 (g/mL)，萃取壓強0.2 MPa，萃取次數(shù)3次，萃取時間30 min，考察萃取溫度(30，35，40，45，50，55，60 ℃)對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

1.4.2 響應面設計 在單因素試驗基礎上，選取萃取次數(shù)、萃取時間、萃取溫度3個因素，利用Design-Expert 10.0 根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進行三因素三水平響應面設計，以油脂萃取率為評價指標，優(yōu)化亞臨界萃取冰島刺參內(nèi)臟油脂的工藝條件。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 所有試驗平行3次，取平均值，采用Origin 8.0軟件進行線性回歸分析及作圖，采用Design-Expert 10.0軟件進行響應曲面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對油脂萃取率的影響 由圖1可知，隨著料液比的逐漸增加，內(nèi)臟油脂的萃取率先升高后略微下降，當料液比(m冰島刺參∶V萃取液)為1∶3 (g/mL)時，萃取效果達到最佳，此時萃取率為17.77%。萃取過程中，高濃度的溶質(zhì)分子會更容易溶出于低濃度的溶劑中，隨著溶劑的增大，溶質(zhì)分子與溶劑會逐漸達到固液溶解平衡。當繼續(xù)增加溶劑，溶質(zhì)分子無法通過固液界面進入溶劑相，萃取率下降。同時，過多的萃取溶劑會使溶劑回收過程中損失部分油脂，還會產(chǎn)生溶劑殘留過量的問題。

圖1 料液比對冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率的影響

2.1.2 萃取壓強對油脂萃取率的影響 由圖2可知，當萃取壓強為0.2～0.4 MPa時，油脂萃取率隨萃取壓強的增加而增大，當萃取壓強為0.4 MPa時，油脂萃取率最大為18.77%。萃取壓強過高會影響物料中部分油脂的溶解性，同時會使部分溶質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，變?yōu)闅鈶B(tài)小分子，無法進入液態(tài)萃取溶劑。因此整體萃取系統(tǒng)的萃取壓強選擇0.4 MPa最佳。

2.1.3 萃取次數(shù)對油脂萃取率的影響 由圖3可知，隨著萃取次數(shù)的增加，冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率不斷升高，當萃取次數(shù)達3次后，繼續(xù)增加萃取次數(shù)，萃取率變化不顯著。其中萃取5次比萃取3次的萃取率僅增加了0.4%，而萃取3次比萃取1次的萃取率增加了8.05%。綜合考慮，選取萃取次數(shù)為3次較佳。

2.1.4 萃取時間對油脂萃取率的影響 由圖4可知，當萃取時間為20～40 min時，萃取時間的延長會顯著影響內(nèi)臟油脂的萃取率，且萃取40 min時的萃取率達17.4%。當萃取時間>40 min時，內(nèi)臟油脂的萃取率變化較小，萃取時間增加至60 min時，油脂的萃取率僅增加了0.9%。因此，萃取時間選擇40 min適宜。

圖2 萃取壓強對冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率的影響

圖3 萃取次數(shù)對冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率的影響

圖4 萃取時間對冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率的影響

2.1.5 萃取溫度對油脂萃取率的影響 由圖5可知，當萃取溫度為30～45 ℃時，隨著萃取溫度的升高，油脂萃取率逐漸升高，當萃取溫度為45 ℃時，油脂萃取率達最高值17.9%。綜上，亞臨界萃取冰島刺參內(nèi)臟油脂的溫度應控制在45 ℃左右。

圖5 萃取溫度對冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結(jié)果 在單因素試驗基礎上，以油脂萃取率為評價指標，以萃取次數(shù)、萃取時間、料液比為考察因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進行三因素三水平響應面試驗，試驗因素水平編碼見表1，試驗方案與結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 10.0軟件對表2進行回歸分析，得回歸方程：

R=21.04+1.38A+1.06B+1.27C+0.97AB+0.83AC-0.018BC-0.92A2-0.89B2-0.90C2。

(2)

表1 響應面試驗因素與水平編碼表

表2 響應面試驗方案與結(jié)果

2.2.3 各因素間的交互作用 由圖6～圖8可知，萃取次數(shù)與萃取時間交互作用最為顯著，其次是萃取次數(shù)與萃取溫度；萃取時間與萃取溫度交互作用的響應面趨于平緩，等高線圖顯示接近于圓，故二者交互作用并不顯著，與響應面方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 萃取工藝條件確定及驗證 分析響應面法試驗數(shù)據(jù)可知，冰島刺參內(nèi)臟油脂模型的極值點A=0.967，B=0.618，C=0.710。經(jīng)計算可得最優(yōu)萃取條件為萃取次數(shù)5次、萃取時間56.18 min、萃取溫度48.55 ℃、最大萃取率23.41%。對最優(yōu)條件進行實驗驗證得萃取率為23.38%，與預測值的相對誤差為0.03%，說明響應面法能較好地對冰島刺參內(nèi)臟油脂的萃取工藝進行回歸分析和優(yōu)化。

2.3 不同萃取方法油脂的理化指標

由表4可知，亞臨界法萃取的冰島刺參內(nèi)臟油脂過氧化值低于其他兩種方法，說明亞臨界工藝的低溫萃取對油脂起到了很好的保護作用；同時所萃取出的油脂水分及揮發(fā)物少，說明亞臨界法的萃取專一性高，有利于油脂的后續(xù)加工。綜合皂化值及碘值數(shù)據(jù)，說明亞臨界法萃取冰島刺參內(nèi)臟油脂具有較大的優(yōu)勢。

2.4 不同萃取方法油脂的GC-MS分析

由圖9可知，亞臨界法萃取的油脂中EPA(47.568 min 出峰)相對含量達40.7%，溶劑法萃取的油脂中EPA(47.506 min出峰)相對含量為33.3%，酶解法萃取的油脂中EPA(47.755 min出峰)相對含量為39.6%，與其他兩種方法相比，亞臨界萃取法萃取的油脂的雜質(zhì)少，且不飽和脂肪酸EPA含量最高。

表3 回歸模型的方差分析?

圖6 萃取次數(shù)與萃取時間的交互作用對冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率的影響

圖7 萃取次數(shù)與萃取溫度的交互作用對冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率的影響

圖8 萃取時間與萃取溫度的交互作用對冰島刺參內(nèi)臟油脂萃取率的影響

表4 不同萃取方法的油脂理化指標

3 結(jié)論

以富含脂類活性物質(zhì)的凍干冰島刺參內(nèi)臟(含性腺、海參腸、胃囊)為原料，利用亞臨界工藝進行油脂萃取。結(jié)果表明，最佳亞臨界萃取工藝條件為料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶3 (g/mL)、萃取壓強0.4 MPa、萃取次數(shù)5次、萃取時間56.18 min、萃取溫度48.55 ℃。此工藝條件下的油脂萃取率為23.38%。通過對比不同萃取方法的油脂的理化指標及氣相色譜圖，發(fā)現(xiàn)亞臨界法萃取的油脂中的氧化程度低，EPA相對含量達40.7%，說明亞臨界法萃取冰島刺參內(nèi)臟油脂的工藝效率高，油脂品質(zhì)更穩(wěn)定。后續(xù)擬開展冰島刺參內(nèi)臟油脂成分全面分析，并進行分離純化。

圖9 不同萃取方法油脂的GC-MS圖譜