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        自身免疫性肝炎小鼠肝組織中的膜聯蛋白A1表達情況▲

        2021-05-10 05:42:16劉耿烽范俊華呂曉丹張怡華曾睿智陳如艷詹靈凌呂小平
        廣西醫(yī)學 2021年4期
        關鍵詞:小鼠血清水平

        劉耿烽 范俊華 呂曉丹 張怡華 曾睿智 陳如艷 詹靈凌 呂小平

        (廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 1消化內科;2 檢驗科,南寧市 530021,電子郵箱:369215736@qq.com)

        自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一種較為少見的特異性自身免疫性肝臟慢性疾病,具體病因尚未明確,但AIH的患病率正逐年增加[1]。AIH可發(fā)生在各個種群及每個年齡階段人群,以女性多見,具有遺傳易感性并且受環(huán)境等因素影響[2]。該病臨床表現多樣化,患者可表現為無癥狀或輕度轉氨酶升高,也可表現為急性肝炎,甚至急性肝衰竭。此外,部分患者可同時出現關節(jié)痛、內分泌功能障礙、皮膚紋和痤瘡等肝外表現[3]。AIH的診斷主要依據以界面性肝炎為特征的肝組織病理學改變、特征性自身免疫抗體陽性、高丙球蛋白血癥。根據血清自身抗體,AIH主要分為兩型:抗核抗體和(或)抗平滑肌抗體陽性的AIH定義為AIH 1型(AIH-1);抗肝腎1型微粒體抗體或抗肝細胞溶質1型抗體陽性的AIH定義為AIH 2型(AIH-2)[4]。AIH治療的目標是阻止并發(fā)癥的發(fā)生以及病情達到完全緩解,早發(fā)現、早治療、早預防并發(fā)癥及阻止其進展,成為治療AIH的關鍵所在。然而臨床上治療AIH的方法有限,目前經典的治療藥物主要是免疫抑制劑和皮質類固醇。由于糖皮質激素或硫唑嘌呤的療效欠佳或所導致的嚴重不良反應,導致患者不易堅持用藥而發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭,最終只能進行肝移植[5-6]。

        膜聯蛋白A1(annexin A1,AnxA1)是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白,可通過多種途徑調節(jié)炎癥反應,抑制中性粒細胞和促炎因子的產生,同時其可受到糖皮質激素的調節(jié)而發(fā)揮抗炎作用[7]。本研究使用刀豆蛋白A建立AIH小鼠模型,通過檢測肝組織AnxA1 mRNA及蛋白的表達水平,探究AnxA1在AIH的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用,為AIH的治療提供新的靶點。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 健康雄性C57BL/6小鼠16只,6~8周齡,體質量為20~22 g,購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心(許可證號: SCXK 桂2014-0002) 。在60% 相對濕度的環(huán)境下飼養(yǎng),自由進食、飲水。

        1.2 主要試劑 刀豆蛋白A購自Sigma公司(貨號:SLBT3093);AnxA1單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體購自Abcam公司(貨號:ab214486、ab181602);生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)購自Invitrogen公司(貨號:TJ26211);TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、定量PCR試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司(貨號:AA1302-1、AI40713A、AI52235A);免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司 (貨號:K197712D);蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解液購自北京索萊寶科技有限公司(貨號:20190910、20190826)。

        1.3 AIH動物模型建立及標本采集 采用隨機數字表法將小鼠分為正常組和模型組,每組8只,正常飲食適應性喂養(yǎng)1周后,模型組小鼠通過尾靜脈注射12.5 mg/kg的刀豆蛋白A進行造模,正常組小鼠通過尾靜脈注射等量的生理鹽水。給藥48 h后取材,頸椎脫臼法處死小鼠,眼球采集血液800~1 000 μL制備血清標本,取小部分肝臟組織用4%甲醛溶液固定,其余肝臟組織存入-80℃冰箱中備用。

        1.4 血清學指標檢測 眼球采血后,收集血液4℃下3 000 r/min離心10 min,留取血清,使用日立7600型全自動生化分析儀檢測血清ALT和AST水平。

        1.5 肝組織病理學檢查 肝組織經過固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。

        1.6 免疫組織化學法檢測肝組織中AnxA1的原位表達 切片經脫蠟和水化后,根據AnxA1單克隆抗體說明書及免疫組化試劑盒要求,進行抗原堿性修復、阻斷內源性過氧化物酶、山羊血清封閉,然后用AnxA1單克隆抗體稀釋液(1 ∶4 000)在4℃條件下孵育過夜,生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG孵育15 min,辣根酶標記鏈霉卵白素孵育15 min,二氨基聯苯胺顯色、復染、脫水、透明、封片,鏡下觀察。

        1.7 肝組織AnxA1 mRNA水平的檢測 稱取30 mg肝組織,剪碎,加入1 mL TRIzol冰上勻漿,按照試劑盒說明書提取總RNA,使用分光光度計進行總RNA定量,根據逆轉錄試劑盒說明書將其反轉錄成cDNA,最后進行實時熒光定量PCR檢測小鼠肝組織AnxA1 mRNA的相對表達量。以GAPDH作為內參。AnxA1上游引物5′-AGCAGATCAAGGCCGCGTA-3′,下游引物5′-CATGGCACCACGGAGTTCA-3′,擴增片段長度為149 bp,由寶生物工程(大連)有限公司合成; GAPDH上游引物為5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游引物為5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′,擴增片段長度為150 bp,由南寧科迪生物技術有限公司合成。根據定量PCR試劑盒說明書配置20 μL反應體系后置于PCR儀(Applied Biosystems公司,StepOne Plus型)中。PCR反應體系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2X) 10 μL,PCR Forward Primer (10μM) 0.8 μL,PCR Reverse Primer (10μM) 0.8 μL, ROX Reference Dye (50X) 0.4 μL,DNA模板 2 μL,dH2o (滅菌)6 μL。PCR反應條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40個循環(huán)。應用2-ΔΔCt計算AnxA1 mRNA 的相對表達水平。

        1.8 肝組織AnxA1蛋白表達水平的檢測 取30 mg肝組織,剪碎,加入蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解液,在冰上用電動組織研磨器研磨勻漿,冰上靜止裂解30 min后4°C、12 000 r/m離心15 min,取上清液。利用分光光度計檢測蛋白質濃度,將蛋白上樣緩沖液加入上清液中混勻,95℃加熱10 min 變性,冷卻后上樣,10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后,電轉移至硝酸纖維素膜,用含5%脫脂奶粉的TBST在搖床上室溫封閉硝酸纖維素膜1 h,將膜放于稀釋后的AnxA1單克隆抗體溶液(1 ∶2 000)和GAPDH 單克隆抗體溶液(1 ∶10 000)中在4℃環(huán)境下孵育過夜,用PBST在搖床上室溫洗硝酸纖維膜3次,10 min/次,然后放入稀釋后的二抗生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)溶液(1 ∶10 000)在搖床上室溫孵育1 h,再用PBST在搖床上室溫洗膜3次,10 min/次,紅外熒光掃描儀成像系統(tǒng)( 美國Bio-Rad 公司,Odyssey型) 照相記錄,Image J 軟件分析目標條帶灰度值。

        1.9 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,GraphPad Prism 8.2軟件進行圖形制作。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示,組間比較采用t檢驗或t′檢驗,非正態(tài)分布的資料以中位數(四分位距)表示,組間比較采用非參數檢驗;采用Pearson檢驗進行相關性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結 果

        2.1 兩組血清指標水平的比較 模型組的血清ALT、AST 中位水平為201(358) U/L、157.5(311) U/L,分別高于正常組的15(8.75) U/L、16(7.50) U/L(z=-3.373,P=0.001;z=-3.363,P=0.001)。

        2.2 兩組小鼠肝組織病理學表現 正常組小鼠肝臟外觀正常,HE染色結果提示肝組織無炎性細胞表達。模型組小鼠肝臟外觀充血腫大,鏡下可見肝細胞腫脹、水樣變性,門管區(qū)和小葉中央區(qū)可見淋巴細胞、單核細胞浸潤,存在界面性肝炎,但無明顯擴大和纖維化。見圖1。

        圖1 小鼠肝組織HE染色結果(×200)

        2.3 兩組小鼠肝組織AnxA1原位表達的比較 正常組小鼠的肝組織沒有陽性細胞表達,而模型組的肝組織可以看到較多的陽性細胞表達,細胞質著色成棕黃色,見圖2。

        圖2 小鼠肝組織AnxA1免疫組織化學染色結果(×200)

        2.4 兩組小鼠肝組織AnxA1 mRNA和蛋白表達水平的比較 模型組小鼠肝組織中AnxA1 mRNA及蛋白的相對表達水平均高于正常組(均P<0.05),見表1及圖3。

        表1 兩組小鼠肝組織AnxA1的mRNA及蛋白相對表達水平的比較(x±s)

        圖3 小鼠肝組織AnxA1蛋白質表達水平

        2.5 AIH小鼠血清轉氨酶水平與肝組織AnxA1表達的相關性 AIH小鼠血清ALT、AST水平與肝組織AnxA1 mRNA相對表達量呈正相關(r=0.887、0.872,均P<0.001),與肝組織AnxA1蛋白的表達也呈正相關(r=0.950、0.908,均P<0.001)。

        3 討 論

        肝臟在人體免疫系統(tǒng)中占有重要的地位,肝臟免疫系統(tǒng)能夠對病原體、炎癥和腫瘤等做出免疫應答。肝臟的免疫耐受性通過樹突細胞、庫普弗細胞、肝竇內皮細胞和肝星狀細胞等抗原呈遞細胞介導。肝臟存在的自然殺傷細胞、CD56+T淋巴細胞、自然殺傷T細胞、γδT細胞和黏膜相關恒定的T淋巴細胞等先天淋巴細胞,不僅能夠識別并殺死外界微生物和消除宿主細胞的代謝產物,促進免疫系統(tǒng)細胞分化及活化,也可以促進抗原呈遞細胞成熟并產生免疫原性T淋巴細胞,還可使肝臟免疫負荷增大從而誘導和維持肝臟損傷,最終引起自身反應性T細胞的自身免疫性肝病[1,8]。AIH的病理特點是炎性細胞浸潤,其中炎性細胞主要由細胞毒性T細胞和漿細胞組成,其在門靜脈周圍浸潤,導致肝實質進行性破壞。CD4+和CD8+T淋巴細胞和漿細胞在肝臟中聚集識別并破壞肝細胞,隨后發(fā)展成肝纖維化,進一步發(fā)展可導致肝硬化和肝衰竭[6,9]。經典的AIH小鼠模型由刀豆蛋白A誘導而成:在刀豆蛋白A的作用下免疫細胞被激活且大量細胞因子被釋放,導致活化的淋巴細胞浸潤肝組織,以及T淋巴細胞活化和向肝臟聚集而引起肝損傷[10-11]。本研究采用向小鼠尾靜脈注射刀豆蛋A法誘導AIH模型,結果顯示,模型組小鼠肝、脾外觀充血腫大,病理組織學提示肝小葉結構完整,肝細胞腫脹、水樣變性,門管區(qū)和小葉中央區(qū)可見淋巴細胞、單核細胞浸潤,但無明顯擴大和纖維化,且模型組血清ALT、AST水平較正常組升高,提示造模成功。

        膜聯蛋白超家族是一類能夠黏附在細胞的磷脂膜上的鈣依賴性磷脂結合蛋白,有4個由60~70個氨基酸組成的核心,并與獨特的N-末端區(qū)域相連,而N-末端決定了各自特殊的作用[12]。AnxA1是鈣依賴性磷脂結合蛋白的超家族中的一員,分子量為37 kDa,由1個N-末端結構域和4個保守的核心結構域重復序列組成。AnxA1在鈣離子(1 mmol/L)存在的情況下,具有與鈣結合后改變構象的能力,且與磷脂有很高的親和力,特別是與磷脂酶A2,這些結構變化可能會影響蛋白質的生物學功能,特別是與潛在受體相互作用的能力[13]。內源性AnxA1也能有效調節(jié)免疫細胞,可以參與機體的抗炎癥反應、腫瘤細胞增殖、凋亡等[14]。AnxA1可以促進Th1細胞產生γ-干擾素、腫瘤壞死因子α和白細胞介素(interleukin,IL)-2,并抑制Th2細胞產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13[15]。Yang 等[16]研究發(fā)現,幼稚CD4+T淋巴細胞可以分化為Th1、Th2、Th17促炎細胞系,誘導轉錄因子和促炎細胞因子的特異性表達,而AnxA1的缺失可導致CD4+T細胞活化和終末器官炎癥反應的增加,同時內源性AnxA1具有抑制所有促炎性CD4+譜系活化的作用。本實驗結果顯示,AHI模型組小鼠肝組織存在AnxA1的表達,且模型組肝組織AnxA1 mRNA及蛋白表達水平均高于正常組,與血清ALT、AST水平均呈正相關,即與肝組織的炎癥反應及肝損傷存在相關性,這表明AnxA1可能與AIH的發(fā)病機制及病情發(fā)展密切相關。

        綜上所述,AIH模型小鼠肝臟組織中AnxA1 mRNA以及蛋白的表達水平均明顯增加,且與肝臟炎癥損傷存在相關性,AnxA1可能在AIH的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。AIH發(fā)病機制復雜且尚不明確,AnxA1在AIH的發(fā)生發(fā)展過程中起到的作用機制、特點、與炎癥因子的相互作用等需要進行更深層次的研究。

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