李 沫，王 靜，何金銘，陳雯新，劉 林，張桂芝*，趙小梅

（1.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276005；2.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276005）

電子顯微鏡下觀察葉綠體，會看到一種嗜鋨顆粒[1-5]，進(jìn)一步研究顯示這些嗜鋨顆粒是由膜脂單分子層包圍三酰甘油、戊烯基醌、類胡蘿卜素等中性脂核的細(xì)胞器，稱為質(zhì)體小球[6-8]。質(zhì)體小球單分子層膜上結(jié)合著維持小球形態(tài)結(jié)構(gòu)的蛋白和負(fù)責(zé)脂代謝的酶[9-10]。質(zhì)體小球的產(chǎn)生機(jī)制是類囊體膜局部區(qū)域兩分子層之間積累中性脂，中性脂積累引起膜膨大，膨大部分最終成為質(zhì)體小球[10-13]。

除參與葉綠體的發(fā)育[14-17]及對多種環(huán)境脅迫的抵御[18-26]之外，質(zhì)體小球的另一個重要功能是在葉綠體衰老過程中發(fā)揮解毒作用。首先，葉綠體衰老時葉綠素分解，在脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶作用下分解產(chǎn)生葉綠醇[27-28]，葉綠醇對細(xì)胞有毒性，必須通過代謝將毒性消減[29]，質(zhì)體小球通過膜結(jié)合的酶將葉綠醇轉(zhuǎn)化為α-生育酚[29-30]或脂肪酸-葉綠醇酯，并貯藏在質(zhì)體小球中[10,31-32]，從而將葉綠醇毒性最小化。其次，葉綠體衰老時類囊體膜解體，半乳糖脂水解產(chǎn)生脂肪酸，脂肪酸有毒[33-34]，質(zhì)體小球通過膜結(jié)合酶將脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯并貯藏在質(zhì)體小球中[31-32]。這些源于類囊體的代謝產(chǎn)物在質(zhì)體小球中積累，導(dǎo)致質(zhì)體小球體積增大[35]。然而，對于這些體積增大了的質(zhì)體小球的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

番茄是廣泛栽培的園藝作物，葉衰老引起胞質(zhì)脂滴出現(xiàn)[36]，但質(zhì)體小球的變化和活動還未見報道。因此，本研究對衰老葉中的質(zhì)體小球進(jìn)行了超微觀察，以期了解質(zhì)體小球的亞細(xì)胞降解途徑，為進(jìn)一步研究質(zhì)體小球降解的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試番茄（Solanum lycopersicum）品種為‘諾亞透明粉’，源自山東省壽光市惠友種苗有限公司。

四氧化鋨（分析純），TED PELLA INC，戊二醛（分析純）和樹脂（分析純），Structure Probe INC，磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、酒精（分析純）和丙酮（分析純），天津市鑫鉑特化工有限公司。先用磷酸鹽配制0.05 mol/L 緩沖液，再用緩沖液配制2%戊二醛溶液和1%四氧化鋨溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

透射電子顯微鏡為JEOL 1220（JEOL），切片機(jī)為ULTRACUT R（Leica）。

1.3 方法

實驗于2017—2018 年進(jìn)行，每年1 月下旬溫室育苗，4 月中旬露地定植，6 月下旬取成熟葉和衰老葉進(jìn)行超微觀察。圖1 中成熟葉的葉片充分?jǐn)U展（圖1A），衰老葉則明顯失綠（圖1B）。

圖1 番茄成熟葉（A）和衰老葉（B）Fig.1 Mature（A）and senescent（B）leaves of tomato

1.4 透射電子顯微技術(shù)

從大田植株切取小塊葉片，立即浸沒在2%戊二醛固定液中，在實驗室內(nèi)切除葉片受傷邊緣，中央部分切成小于1 mm×1 mm 的小塊，放回2%戊二醛固定液中繼續(xù)固定，時間總計達(dá)12 h，期間抽出葉組織內(nèi)的氣體。樣品經(jīng)0.05 mol/L 磷酸緩沖液洗滌后，用1%四氧化鋨溶液固定2 h。之后用乙醇脫水，再用丙酮置換出樣品中的乙醇，將樣品包埋于Embed-812 樹脂中，切片，厚度為60 nm。切片用5%醋酸鈾染色10 min，再用0.1%檸檬酸鉛染色2 min，透射電子顯微鏡下觀察質(zhì)體小球[5,36,38]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 數(shù)據(jù)分析軟件對葉衰老前后的質(zhì)體小球數(shù)量、直徑和體積進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉衰老前后質(zhì)體小球大小和數(shù)量變化

表1 葉衰老前后葉綠體每個切片上質(zhì)體小球數(shù)量、直徑和體積Table 1 Plastoglobule number,diameter and size per section of the chloroplast in leaves before and after senescence

表1 顯示了葉衰老前后葉綠體切片上質(zhì)體小球的數(shù)量、直徑和體積。直徑從0.08～0.13 μm，平均直徑（0.1±0.03）μm。按照直徑平均值，成熟葉質(zhì)體小球的體積平均為6.7×10-4μm3。

圖2 成熟葉中的質(zhì)體小球Fig.2 Plastoglobules in mature leaves

圖2 為番茄成熟葉的葉綠體，葉綠體不同切片上質(zhì)體小球數(shù)量差異表明質(zhì)體小球在葉綠體內(nèi)的分布極不均勻，番茄成熟葉葉綠體每張切片上都含有質(zhì)體小球，但不同切片上質(zhì)體小球數(shù)量差別很大，少者僅幾個，多者十幾個，質(zhì)體小球電子密度大，呈現(xiàn)為黑色顆粒。

由表1 知，衰老葉不同切片上質(zhì)體小球數(shù)量差異較大，少至2 個，多達(dá)7 個，平均（5.00±1.8）個。衰老葉葉綠體中的質(zhì)體小球數(shù)量與成熟葉基本沒有差別，但是質(zhì)體小球的體積顯著增大，直徑為0.42～0.80 μm，平均直徑（0.56±0.12）μm，約為成熟葉質(zhì)體小球平均直徑的5.6倍。按照直徑平均值，衰老葉質(zhì)體小球體積平均為1.1×10-1μm3，較葉衰老前明顯增大。

與成熟葉相似，衰老葉葉綠體每張切片上也都含有質(zhì)體小球（圖3、4），與成熟葉相比，衰老葉的質(zhì)體小球電子密度大大降低，除表面仍然呈黑色外，內(nèi)部變淺至灰色（圖3），僅個別質(zhì)體小球保持較大的電子密度（圖4A～C）。

圖3 衰老葉中的質(zhì)體小球Fig.3 Plastoglobule in senescent leaves

圖4 衰老葉質(zhì)體小球的降解Fig.4 Plastoglobule degrdation in senescent leaves

2.2 衰老葉中質(zhì)體小球的活動

衰老葉中的質(zhì)體小球有兩種值得注意的活動。第一種是向葉綠體外分泌，如圖3A 所示，有一個胞質(zhì)脂滴與葉綠體相連，雖然沒有規(guī)則的形狀，但具有與質(zhì)體小球相似的電子密度，根據(jù)密切的位置關(guān)系和相似的電子密度判斷，這個胞質(zhì)脂滴是剛從葉綠體內(nèi)分泌出來的質(zhì)體小球。在圖3B 中，葉綠體中央的質(zhì)體小球具有圓形輪廓，而葉綠體邊緣的質(zhì)體小球失去圓形輪廓，呈彎月形，顯示是不完整的質(zhì)體小球，彎月形的凹面正對著葉綠體外的胞質(zhì)脂滴。胞質(zhì)脂滴緊貼著葉綠體，并向著葉綠體內(nèi)彎月形質(zhì)體小球的凹面突起，間隙極小，顯示質(zhì)體小球正在向葉綠體外分泌，胞質(zhì)脂滴就是從葉綠體分泌出來的質(zhì)體小球。胞質(zhì)脂滴沒有固定的形狀，與質(zhì)體小球形成鮮明對比。質(zhì)體小球從相鄰葉綠體分泌出來后立刻融合成一個胞質(zhì)脂滴，這與質(zhì)體小球明顯不同（圖3B）。較大的胞質(zhì)脂滴，尤其是剛從葉綠體分泌出來的較大脂滴，其電子密度與質(zhì)體小球類似，而較小的脂滴，尤其不與葉綠體接觸的胞質(zhì)脂滴，通常具有很高的電子密度（圖4B）。胞質(zhì)脂滴會出現(xiàn)在中央大液泡中，在液泡內(nèi)發(fā)生降解（圖4A、B）。觀察表明細(xì)胞質(zhì)中沒有包裹著脂滴的自噬小體。脂滴往液泡內(nèi)突入（圖3A），顯示脂滴直接被液泡吞噬。與衰老葉不同，成熟葉沒有質(zhì)體小球向葉綠體外分泌的活動，細(xì)胞質(zhì)中也沒有胞質(zhì)脂滴（圖2），顯示質(zhì)體小球向葉綠體外分泌并進(jìn)入液泡的活動只在衰老葉內(nèi)發(fā)生。

質(zhì)體小球的另一種活動是它在葉綠體內(nèi)發(fā)生原位降解。質(zhì)體小球降解時，伴隨出現(xiàn)一個電子密度較低或透明的斑（圖3A、B），然后透明斑不斷擴(kuò)大（圖4B～D），顯示降解從一點開始，向四周擴(kuò)展。隨著體積不斷增大，透明斑顯示不同的形狀，如圖4B 所示，透明斑變成了圓形，而在圖4C 和4D 中，透明斑變成了凸透鏡形。圓形透明斑套在質(zhì)體小球內(nèi)部（圖4B），凸透鏡形透明斑則與質(zhì)體小球并列（圖4C、D）。不同的位置關(guān)系是切片角度不同造成的，如果切片方向與連線平行，則透明斑與質(zhì)體小球并列（圖4C、D）；如果切片方向與透明斑和質(zhì)體小球中心連線垂直，則透明斑位于質(zhì)體小球內(nèi)部（圖4A、B）。透明斑與質(zhì)體小球接觸面上質(zhì)體小球凹陷，而透明斑凸起，透明斑與質(zhì)體小球構(gòu)成橢球形（圖4C、D）。透明斑與葉綠體基質(zhì)之間的界面上有膜（圖4C），表明透明斑實際上是小泡。

圖5 質(zhì)體小球（PG）降解與小泡（V）關(guān)系示意圖Fig.5 Diagram of the association between plastoglobule (PG)and vesicle (V)

圖5 顯示了質(zhì)體小球（PG）降解與小泡（V）關(guān)系，由圖知，小泡隨著質(zhì)體小球的降解而不斷增大；降解程度越大，小泡就越大（圖5）。在葉綠體切片上，不是所有質(zhì)體小球都發(fā)生原位降解，表明質(zhì)體小球的原位降解是不同步的。

3 討論

本研究顯示，番茄衰老葉中質(zhì)體小球顯著增大，但數(shù)量并無明顯變化，體積增大了的質(zhì)體小球接下來進(jìn)行兩種活動：一是向葉綠體外分泌，然后進(jìn)入液泡內(nèi)降解；二是在葉綠體內(nèi)發(fā)生降解。脂滴在葉綠體內(nèi)的降解也稱原位降解[37-38]。

番茄衰老葉中質(zhì)體小球分泌到葉綠體外成為胞質(zhì)脂滴，來自質(zhì)體小球的胞質(zhì)脂滴形狀不規(guī)則。脂滴的形狀取決于其表面上的結(jié)構(gòu)蛋白組分，結(jié)構(gòu)蛋白組分改變，脂滴形狀就會隨之改變[39]。質(zhì)體小球表面約有30 種蛋白質(zhì)，多數(shù)為結(jié)構(gòu)蛋白，少數(shù)為酶[16,19,40]。其中含量最為豐富的是纖維蛋白，屬于結(jié)構(gòu)蛋白，以纖維形式存在于質(zhì)體小球表面，形成質(zhì)體小球疏水核與葉綠體基質(zhì)親水環(huán)境之間的相容性界面，從而維持質(zhì)體小球結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，防止質(zhì)體小球彼此合并[39,41-42]。番茄葉衰老過程中，質(zhì)體小球從葉綠體分泌出來就失去了原來的形狀，而且彼此易于合并，與質(zhì)體小球形成鮮明對比，這意味著質(zhì)體小球在分泌過程中失去了相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白的缺失使得離開葉綠體的質(zhì)體小球無法維持穩(wěn)定形狀和彼此獨立，相互之間極易合并。

番茄衰老葉內(nèi)，質(zhì)體小球從分泌到進(jìn)入中央大液泡，體現(xiàn)了降解的液泡途徑。質(zhì)體小球向液泡外分泌而成為胞質(zhì)脂滴，但細(xì)胞質(zhì)中沒有積累大量胞質(zhì)脂滴，這與之前的觀察結(jié)果類似[36]。可能質(zhì)體小球分泌到葉綠體外之后不久就進(jìn)入液泡內(nèi)降解，所以胞質(zhì)脂滴不會大量積累。細(xì)胞組分進(jìn)入液泡內(nèi)發(fā)生降解的過程屬于自噬[43]，自噬分為巨自噬和微自噬，先形成自噬小體再被液泡吞噬稱為巨自噬，直接被液泡吞噬稱為微自噬[44]。番茄衰老葉內(nèi)沒有觀察到包含脂滴的自噬小體，脂滴直接被液泡吞噬，所以脂滴進(jìn)入液泡的過程屬于微自噬。研究表明葉衰老后自噬相關(guān)基因和定位于液泡的的脂酶基因表達(dá)水平急劇升高[45-48]，為脂滴降解的液泡途徑提供了分子基礎(chǔ)。要了解番茄衰老葉內(nèi)自噬相關(guān)基因以及定位于液泡的脂酶基因的表達(dá)水平變化情況，還需要進(jìn)一步探索。

番茄衰老葉綠體內(nèi)質(zhì)體小球降解伴隨透明斑的發(fā)生，暗示質(zhì)體小球降解遵循一條小泡途徑。利用蛋白質(zhì)組技術(shù)在質(zhì)體小球上發(fā)現(xiàn)了PES1 和PES2[9]，兩個屬于酯酶/脂肪酶/硫酯酶家族的成員。這兩種酶都具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性，催化脂肪酸與二酰甘油反應(yīng)生成三酰甘油，脂肪酸與葉綠醇反應(yīng)生成脂肪酸葉綠醇酯[31-32]。在衰老葉中，這兩種酶的表達(dá)水平急劇升高[31]。然而，質(zhì)體小球上缺少負(fù)責(zé)甘油三酯水解的脂酶[9]。如果質(zhì)體小球在葉綠體內(nèi)降解，一個關(guān)鍵問題是，脂酶從何而來。首先考慮一下位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的胞質(zhì)脂滴，其表面也沒有脂酶，其降解遵循液泡途徑或乙醛酸循環(huán)體途徑[49-50]。在液泡途徑中，液泡為脂滴提供脂酶；在乙醛酸循環(huán)體途徑中，乙醛酸循環(huán)體將脂酶輸送到脂滴表面[49]。乙醛酸循環(huán)體途徑發(fā)生于發(fā)芽種子中。油性種子發(fā)芽時，乙醛酸循環(huán)體與脂滴接觸，從而將脂酶呈遞到脂滴表面，脂酶催化貯藏脂水解，產(chǎn)生脂肪酸[49]。游離脂肪酸有毒[33-34]，過氧化物酶體將其收集，通過β-氧化途徑和乙醛酸循環(huán)途徑將脂肪酸轉(zhuǎn)化成無毒性的琥珀酸，琥珀酸離開乙醛酸循環(huán)體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成可運輸?shù)奶?，供幼苗生長所需[49]。脂酶要作用于質(zhì)體小球，需要先跨越葉綠體膜，再以某種方式傳遞到質(zhì)體小球表面。本研究顯示，番茄質(zhì)體小球在葉綠體內(nèi)降解時伴隨產(chǎn)生透明斑，透明斑有膜邊界，實質(zhì)上是一種小泡。小泡與質(zhì)體小球的密切聯(lián)系讓人聯(lián)想到種子發(fā)芽時乙醛酸循環(huán)體與胞質(zhì)脂滴的相互作用，產(chǎn)生對小泡是否像乙醛酸循環(huán)體那樣參與質(zhì)體小球降解的猜測。與乙醛酸循環(huán)體比較，小泡有一個特別之處，即它的體積隨著質(zhì)體小球的降解而不斷增大。本研究為質(zhì)體小球降解的生化分析提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

顯然，葉衰老誘導(dǎo)質(zhì)體小球體積增大，并導(dǎo)致質(zhì)體小球通過兩條亞細(xì)胞途徑降解：一條途徑是質(zhì)體小球分泌到葉綠體外之后再轉(zhuǎn)運到液泡內(nèi)，在液泡內(nèi)降解；另一條途徑是在葉綠體內(nèi)通過小泡的參與而降解，表現(xiàn)為正在降解的質(zhì)體小球總是與小泡相聯(lián)系。小泡途徑降解的分子機(jī)制還不清楚，是未來需要解決的問題。了解質(zhì)體小球降解的分子機(jī)制有助于探索葉片的衰老機(jī)制，并進(jìn)一步實現(xiàn)對衰老葉大分子養(yǎng)分的回收利用。