徐浩 薛瑞 李娟 李波 陳舟 樸蓮花 常珊 孔韌

摘? ? 要：通過使用分子對接與虛擬篩選技術(shù)，以SARS-CoV-2主蛋白酶（Main Protease，Mpro）為靶點，利用Autodock Vina軟件和Python腳本進行分子對接，結(jié)合小分子的對接評分與結(jié)合模式分析，篩選出特異性作用于主蛋白酶的小分子抑制劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以SARS-CoV-2主蛋白酶原配體N3為對照，Reactive blue 2等分子具有更好的對接打分與合理的結(jié)合模式，或可成為潛在的主蛋白酶小分子抑制劑，可為尋找抗新冠病毒治療藥物提供線索。

關(guān)鍵詞：分子對接;COVID-19;虛擬篩選;主蛋白酶;小分子抑制劑

中圖分類號：R914? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2095-7394（2021）02-0065-07

2019年12月，我國武漢市出現(xiàn)了一種傳染性極強的疾病[1]，其病原體被發(fā)現(xiàn)是一種新的冠狀病毒，世界衛(wèi)生組織將這種新型冠狀病毒感染的肺炎命名為“COVID-19”。由于引發(fā)該肺炎的冠狀病毒與引發(fā)SARS的冠狀病毒具有高度親緣性[2]，因此該病毒被命名為“SARS-CoV-2”。2020年1月30日，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization）宣布該事件為國際公共衛(wèi)生事件，并于3月11日報告該疫情為全球性大流行。這是由冠狀病毒導(dǎo)致的首次全球疫情大流行。截至2020年10月20日，全球累計確診病例已超4 000萬。由于SARS-CoV-2是一種先前未在人類群體中發(fā)現(xiàn)的β屬新型冠狀病毒，因此目前沒有特效治療藥物[3]。隨著感染人數(shù)的逐漸上升，防控和救治已經(jīng)成為全球性難題。作為一種β冠狀病毒，SARS-CoV-2的遺傳物質(zhì)是單股正鏈RNA，控制冠狀病毒復(fù)制的主蛋白酶Mpro在病毒生命周期中有重要作用，Mpro與小核糖核酸病毒3C蛋白酶具有相似的切割位點特異性，這一酶通常被稱作3CL蛋白酶[4]。Mpro及其同源酶在病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中起到重要作用，因而Mpro受到研究者們的關(guān)注[5-7]，該蛋白酶可成為抗新冠病毒藥物的重要靶標。

相較2003年的SARS-CoV病毒疫情，COVID-19波及范圍廣、持續(xù)時間長，雖然目前疫情已經(jīng)得到了較好的控制，但特異性治療藥物缺乏仍是一大問題。因此，尋找新冠病毒主蛋白酶的抑制劑對于抑制此次疫情具有重要的意義[8-9]。本文運用分子對接技術(shù)，對Mpro主蛋白酶與小分子的結(jié)合進行計算機模擬。對于篩選得到的分子，分析其結(jié)合模式，與晶體結(jié)構(gòu)做對比，篩選出具有較為合理結(jié)合模式的潛在抑制劑分子，為尋找可能的抗新冠病毒藥物提供線索。

1? ?方法與材料

1.1? 復(fù)原對接

分子對接實驗采用AutoDock Vina[10-11]進行，該程序采用了拉馬克遺傳算法，結(jié)合基于網(wǎng)格的能量估計。為了檢驗對接實驗參數(shù)的可行性，對晶體結(jié)構(gòu)進行了復(fù)原對接。從RCSB PDB庫中下載PDBID為6LU7的SAR-CoV-2主蛋白酶與抑制劑的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分辨率為2.16 ?。將受體蛋白作加氫處理，配體選擇可旋轉(zhuǎn)柔性鍵，使用標準化的流程得到pdbqt文件。以晶體結(jié)構(gòu)中配體的中心位置為對接實驗中盒子的中心坐標（center_x = -10.85，center_y = 2.58，center_z = 68.72），定義盒子大小為30×30×30 ?，使其包圍整個活性口袋區(qū)域。對小分子配體進行加氫處理，并賦予Gasteiger電荷。設(shè)置Exhaustiveness參數(shù)為12，并定義輸出打分最佳的十個構(gòu)像。采用PyMOL和LigPlot進行結(jié)合模式分析[12-13]。

1.2? 小分子數(shù)據(jù)庫建立與配體準備

篩選所需要的配體來源于LOPAC?1280-藥理學(xué)活性化合物文庫，合集包括1 280種小分子化合物，其中大部分為已上市的藥物分子。下載所有小分子文件，采用Openbabel[14]生成小分子的三維坐標。采用AutoDock添加部分電荷信息轉(zhuǎn)換文件格式，得到pdbqt格式的配體文件（批量處理利用python腳本完成）。

1.3? 虛擬篩選

復(fù)原對接的結(jié)果顯示原配體成功對接到靶蛋白的活性中心，表明對接參數(shù)設(shè)置合理。將靶蛋白與原配體的對接結(jié)果作為陽性對照，用python腳本SailVina調(diào)用Autodock Vina對小分子化合物庫進行批量處理，通過AutoDock Vina得到每一個小分子對應(yīng)的對接打分情況。本研究篩選出小分子庫中打分排名前十位的化合物，并對它們與受體的相互作用及結(jié)合模式進行分析，尋找效果最佳的可能的小分子抑制劑。

2? ? 結(jié)果與討論

2.1? 復(fù)原對接結(jié)果分析

6LU7結(jié)構(gòu)由SAR-CoV-2 Mpro與對應(yīng)的N3抑制劑結(jié)合形成，并且表現(xiàn)出配體與活性點位殘基的多個分子間相互作用。由文獻[15]可知，在6LU7對應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu)中，主蛋白酶由三個結(jié)構(gòu)域組成，N3通過與主蛋白酶底物結(jié)合裂縫中殘基的多種相互作用而穩(wěn)定下來。其中，Cys145殘基上的S與乙烯基的C發(fā)生邁克爾加成形成共價鍵，鍵長1.80 ?，在抑制蛋白活性中起到關(guān)鍵性作用。His163、Gly143、Glu166、Phe140等與N3分子形成多個氫鍵相互作用。N3分子上的Leu嵌入His41、Met49、Met165、Tyr54形成疏水分子口袋，而Ala則被Met165、Leu167的側(cè)鏈包圍，發(fā)生疏水相互作用。

使用6LU7晶體結(jié)構(gòu)進行復(fù)原分子對接，得到的最佳打分結(jié)果為-8.40 kcal/mol。在PyMOL中觀察復(fù)原對接的結(jié)合模式，并分別計算出不同構(gòu)像與原配體間的RMSD[16]。二號構(gòu)像與原配體最相似，且算得RMSD值為1.99 ?（<2 ?）（見圖1），說明復(fù)原對接效果良好。上述結(jié)果表明，對接參數(shù)設(shè)置較為合理，復(fù)原對接獲得成功。

[4] HALL D C，JI H F. A search for medications to treat COVID-19 via in silico molecular docking models of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein and 3CL protease[J]. Travel medicine and infectious disease，2020，35：101646. doi： 10.1016/j.tmaid.2020.101646.

[5] RAJESH G，AYON C，ASHIS B，et al. Evaluation of green tea polyphenols as novel corona virus （SARS CoV-2）main protease（Mpro）inhibitors-an in silico docking and molecular dynamics simulation study[J]. Journal of biomolecular structure & dynamics，2020，760：1-13

[6] 賡迪，龐月笙，陶志，等.基于分子對接技術(shù)探討金蓮花湯抗新型冠狀病毒（2019-nCoV）的潛力 [J].中國現(xiàn)代中藥，2020，22（04）：522-532.

[7] 吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，艾尼瓦爾·吾買爾，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探索金花清感顆粒輔助治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）活性成分研究[J].中藥材，2020， （05）：1275-1283.

[8] 劉千勇，王曉良.新型冠狀病毒（2019-nCoV）的靶向藥物研究策略[J].藥學(xué)學(xué)報，2020，55（02）： 181-188.

[9] 張超，陳姝冰，張潔，等.淺析注冊用于新冠肺炎治療的臨床試驗藥物[J].藥學(xué)學(xué)報，2020， 55（03）：355-365.

[10] TROTT O，OLSON A J. AutoDock Vina：improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function，efficient optimization，and multithreading[J]. Journal of Computational Chemistry，2010，31（2）：455-61.

[11] FORLI S，HUEY R，PIQUE M E，et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite[J]. Nature Protocols，2016，11（5）：905-919.

[12] LASKOWSKI R A，SWINDELLS M B. LigPlot+：multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery[J].Journal of Chemical Information and Modeling，2011，51（10）：2778-2786.

[13] LEE J H，HEO J H，CHANG S O，et al. Reactive blue 2，an antagonist of rat P2Y4，increases K+ secretion in rat cochlea strial marginal cells[J]. Hearing Research，2006，219（1）：66-73.

[14] O'BOYLE N M，BANCK M，JAMES C A，et al. Open Babel：An open chemical toolbox[J]. Journal of cheminformatics，2011，3：33.

[15] JIN Z，DU X，XU Y，et al. Structure of M（pro）from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors[J]. Nature，2020，582（7811）：289-293.

[16] BRUSCHWEILER R. Efficient RMSD measures for the comparison of two molecular ensembles.Root-mean-square deviation[J]. Proteins，2003，50（1）：26-34.

[17] MARUYAMA K. Interaction of 4-carboxy-2-hydroxymuconate-6-semialdehyde dehydrogenase with Reactive Blue 2 and related dyes[J]. Journal of Biochemistry，1988，103（4）：714-721.

[18] CHANDLER C E， WILDER D E，PETTINI J L， et al. CP-346086：an MTP inhibitor that lowers plasma cholesterol and triglycerides in experimental animals and in humans[J]. Journal of Lipid Research，2003，44（10）：1887-1901.

[19] WIESBECK G A，WEIJERS H-G，CHICK J，et al. The effects of ritanserin on mood， sleep， vigilance， clinical impression， and social functioning in alcohol-dependent individuals. Ritanserin in Alcoholism Work Group [J]. Alcohol and Alcoholism，2000，35（4）：384-389.

[20] SCOTT A K. Dihydroergotamine：a review of its use in the treatment of migraine and other headaches[J]. Clinical Neuropharmacology，1992，15（4）：289-296.

[21] DOMAN T N，MCGOVERN S L，WITHERBEE B J，et al.Molecular docking and high-throughput screening for novel inhibitors of protein tyrosine phosphatas -1B[J]. Journal of Medicinal Chemistry，2002，45（11）：2213-2221.

責(zé)任編輯? ? 王繼國