方焱秋,顧達(dá)夫

長春市新牧科技有限公司，吉林長春 130000

長春市新牧科技有限公司種公牛站，成立于1996 年，是集純種肉種牛凍精生產(chǎn)、科研與教學(xué)基地為一體的公司，這里有國內(nèi)一流的肉用種牛、基礎(chǔ)設(shè)施和科技隊伍?，F(xiàn)存欄種公牛115 頭，大部分為純種加拿大品系的西門塔爾種公牛，是全國加系存欄最多的種公牛站。2020 年生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)凍精200萬劑，凍精除滿足本省需求外，還遠(yuǎn)銷全國各地，廣泛受到市場歡迎。對推動肉牛產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程起到了積極作用。冷凍精液的技術(shù)，主要用于豬、牛、鹿、馬等動物上。凍精可長期保存于液氮中，按需隨用隨取。具有保存成本低、效率高、運輸方便的特點，是大規(guī)模遺傳改良的主要手段?，F(xiàn)在就肉種牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)做以下介紹。

1 實驗室要求

儀器：相差顯微鏡、噴墨灌裝一體機(jī)、冷凍儀、密度儀、平衡柜、電子天平、水浴鍋、鼓風(fēng)干燥箱、培養(yǎng)箱、液氮罐等。室溫:20 ～24 ℃。

2 精液要求

原精要求：原精量≥3 mL，密度≥6 億/ mL，活力≥0.65，畸形率≤0.15，原精顏色氣味無異常，方可用于凍精生產(chǎn)。

0.25 mL 微管凍后要求：有效精子數(shù)≥800萬個，畸形率≤0.18，凍后活力≥0.35，劑量≥0.18ml，細(xì)菌數(shù)≤800個，細(xì)管無裂痕，封口嚴(yán)密，字跡清晰，信息齊全（包括單位名稱、公牛品種、注冊號、生產(chǎn)日期）。樣品中任何一項未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，均視為不合格產(chǎn)品，做銷毀處理。

3 原精檢查

將集精杯置于30 ～34 ℃水浴鍋中，對顏色、氣味、精液量、活力和密度指標(biāo)進(jìn)行檢測。

3.1 顏色氣味

正常的顏色應(yīng)為乳白色或微黃色，氣味略腥；不正常的顏色偏紅為血精，顏色偏黃為有炎癥，建議獸醫(yī)治療；集精杯里如果有糞便或草渣為污染精液，可能存在細(xì)菌超標(biāo)。以上不正常的原精均棄掉。

3.2 精液量

分為稱量法和目測法兩種方法，稱量法比目測法更為精確。①稱量法：按照精液比重1.04 換算成毫升，公式：采精量（mL）=[總重量（g）-集精杯重量（g）]/1.04。②目測法：通過讀取集精杯刻度毫升數(shù)。

3.3 活力

按百分率判定，差值5%。取集精杯中部精液一小滴于38 ℃載玻片上，加蓋玻片，讓其自然展開，置于500 倍相差顯微鏡下觀察其活力，至少8 個視野?？雌鋱D像觀察：①精子的飽滿程度，運動速度和運動軌跡。②畸形的精子主要有發(fā)育不全的精子，頭部畸形、頸部畸形或尾部畸形。③原生質(zhì)滴的形態(tài)及數(shù)量。④背景的清晰度。這些因素都會影響精子的耐凍性，從而影響凍精質(zhì)量。符合要求的精液進(jìn)行稀釋生產(chǎn)。

3.4 密度

使用精子密度儀進(jìn)行密度測定，根據(jù)原精量和活力數(shù)值測定出每毫升精液中的精子密度，計算稀釋量進(jìn)行稀釋。

3.5 生產(chǎn)臺賬

及時記錄生產(chǎn)臺賬，項目有：公牛號、原精量、密度、活力、稀釋量、生產(chǎn)細(xì)管數(shù)、凍后活力。

4 稀釋、分裝、平衡

4.1 稀釋液配制及稀釋

4.1.1 稀釋液配制

4.1.1.1 自配稀釋液

①稱量藥品→加雙蒸餾水溶解后定容→過濾→消毒。

②取a 液→加甘油→加卵黃→加抗生素→攪拌→待用。

4.1.1.2 進(jìn)口稀釋液制備

原液→加雙蒸餾水→攪拌→待用。

4.1.2 稀釋精液

原精各項指標(biāo)合格后，方可進(jìn)行稀釋。高倍稀釋時，先進(jìn)行低倍稀釋，以防止因過快改變生存環(huán)境造成傷害，也叫稀釋打擊。先取原精3 倍的等溫稀釋液（30 ～34 ℃），傾斜沿集精杯壁，緩慢加入集精杯中，沖洗3 次倒入稀釋瓶中。置于室溫（20 ～24 ℃）自然降溫10 min 后，再用室溫稀釋液加至總量?；靹蚝螅脟娔蛴∫惑w機(jī)進(jìn)行灌裝。

4.2 分裝

細(xì)管要求字跡清晰，信息齊全，封口嚴(yán)密。

4.3 平衡

精子的平衡溫度為4 ℃，是稀釋后的精子在降溫和低溫下的一個適應(yīng)過程，目的為保護(hù)精子突然遭受低溫打擊。封口后的細(xì)管精液上架放入平衡柜3 ～4 h 平衡，要求擺放方向一致，棉塞封口端靠近操作者，以便下一步操作。

5 冷凍

精液冷凍時，對溫度變化非常敏感，冷凍溫度不適宜直接造成精子死亡。

冷凍儀：設(shè)定溫度-120 ℃，精液由平衡柜4℃直接轉(zhuǎn)入冷凍儀-120 ℃冷凍8 min，溫差大，精子冷打擊大，凍后活力稍差。

全自動冷凍儀：設(shè)定最佳冷凍曲線（見圖1），精液由平衡柜4 ℃轉(zhuǎn)入冷凍儀4℃進(jìn)入冷凍程序，8 min 由4 ℃降溫至-140 ℃。快速越過冰晶危險區(qū)域（0 ～-60 ℃），進(jìn)入玻璃化狀態(tài)，（-130 ℃以下）使精細(xì)胞免受冰結(jié)晶凍害，精子復(fù)蘇率高。

圖1 精液冷凍曲線

冷凍儀與全自動冷凍儀的對比試驗：經(jīng)HAMILTON THORNE(精子分析儀)檢測：原精活力81.97%，全自動冷凍儀凍后活力為55.06%，冷凍儀凍后活力為51.14%，兩臺儀器凍后差異為3.92%。

6 凍后檢測

6.1 外觀：細(xì)管無裂痕封口嚴(yán)密。

6.2 凍后活力檢測：迅速從液氮中提取凍精放入38 ℃水浴鍋30 s 解凍。推針推入小試管搖勻后，取1 小滴于38 ℃載玻片上，加蓋玻片。自然展開置于500 倍相差顯微鏡下，觀察視野中呈直線前進(jìn)運動精子占總精子數(shù)的百分率，觀察四個視野以上，進(jìn)行綜合評定，≧0.35 的視為凍精活力合格。凍后合格的精液裝入液氮生物容器，待質(zhì)檢部檢測畸形率、有效精子數(shù)、劑量、細(xì)菌數(shù)等各項指標(biāo)合格后，轉(zhuǎn)入銷售部門銷售，反之銷毀處理。

7 消毒

7.1 高溫消毒：玻璃器皿。

7.2 紫外線消毒：包裝袋、細(xì)管、槍頭。

7.3 75%酒精消毒：膠塞、鮮雞蛋、蓋玻片、載玻片。

7.4 巴氏消毒：稀釋液。

8 季節(jié)對精子的影響

種公牛對高溫天氣的反應(yīng)，這種現(xiàn)象叫熱應(yīng)激。熱應(yīng)激會造成精子活力的下降，直接影響精子的品質(zhì)：死精、畸形精子數(shù)量增加。在凍精生產(chǎn)過程中，精子抗應(yīng)激能力減弱。這時根據(jù)精子耐凍情況，適當(dāng)減少稀釋量來保證產(chǎn)品質(zhì)量。

9 凍精生產(chǎn)的注意事項

9.1 溫度：精子對溫度的變化十分敏感，它只能在一定時間一定溫度范圍內(nèi)存活，過高或過低都會導(dǎo)致精子受損甚至死亡。

9.1.1 牛體溫→采精內(nèi)胎溫度38 ℃→水浴鍋溫度30 ～34 ℃→室溫20 ～24 ℃→平衡溫度4 ℃（3 ～4 h）→全自動冷凍儀4 ～-140 ℃（冷凍曲線）→液氮生物容器-196 ℃。在整個冷凍精液生產(chǎn)中，溫度逐步下降禁止溫度回升。

9.1.2 以精液溫度為標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)節(jié)所需稀釋液和器皿溫度。精液容器做好明顯的信息標(biāo)記。

9.2 時間：原精送入實驗室后，應(yīng)盡快迅速準(zhǔn)確操作，減少由于時間長精子活動代謝消耗能量，造成活動能力減弱或死亡。

9.3 光照：對排除體外的精子，光照是有害的。光能在精子內(nèi)引起光化反應(yīng)，產(chǎn)生對精子有害的過氧化氫。因此精液稀釋處理應(yīng)盡量減少和避免光的照射。

9.4 包裝好的冷凍精液，由一個液氮生物容器轉(zhuǎn)換到另一個容器時，停留時間不得超過5 s。

9.5 凍精檢測合格，按照品種、牛號分別儲存在液氮生物容器中，定期檢查，保證液氮充足。

冷凍精液的生產(chǎn)，是一項嚴(yán)謹(jǐn)精細(xì)的工作，只有將精液產(chǎn)品保存在適當(dāng)環(huán)境條件下操作，才能生產(chǎn)出合格凍精。

總而言之，冷凍精液的生產(chǎn)，極大減少了種牛的飼養(yǎng)數(shù)量，節(jié)約成本，最大限度地提高優(yōu)秀種公牛的利用率和覆蓋率，充分發(fā)揮良種公畜的遺傳潛力，對推進(jìn)肉牛產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程具有重大意義。