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        NIH 稀毛小鼠認知情緒等行為學相關(guān)特性的測定

        2021-05-08 05:31:28冀中豪于小亞任文陟胡進平
        吉林畜牧獸醫(yī) 2021年3期
        關(guān)鍵詞:迷宮物體小鼠

        冀中豪,于小亞,任文陟,陳 健,胡進平*

        1.長治醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部,山西長治 046000;2.吉林省科技創(chuàng)新平臺管理中心,吉林長春 130062;3.吉林大學動物科學學院,吉林長春 130062;

        實驗小鼠是最常使用的一種模式動物,在生命科學和醫(yī)學研究中發(fā)揮著巨大的作用。NIH 稀毛小鼠是被毛異常的自發(fā)突變鼠,其背景品系是封閉群NIH 小鼠,為常染色體隱性遺傳。毛囊的生長發(fā)育包括形態(tài)發(fā)生和周期循環(huán)兩個階段,目前研究發(fā)現(xiàn)的多種被毛突變小鼠模型主要表現(xiàn)為周期循環(huán)階段的異常,例如典型的Hr 基因突變小鼠表現(xiàn)為漸進性脫毛,而NIH 稀毛小鼠屬于形態(tài)發(fā)生期存在異常表現(xiàn)為出生后一直保持稀毛甚至無毛的狀態(tài)。前期研究中對NIH 稀毛小鼠的皮膚結(jié)構(gòu)和免疫相關(guān)的生物學特性進行了觀察和測定,發(fā)現(xiàn)NIH 稀毛小鼠表皮層增厚、毛發(fā)周期轉(zhuǎn)換異常,單增李斯特桿菌感染實驗表明相較于NIH 小鼠其免疫力降低。

        使用最廣泛的一種被毛異常小鼠是裸小鼠,其胸腺缺失T 細胞缺陷而導(dǎo)致的免疫低下使其適用于腫瘤、免疫和感染等相關(guān)方向的研究。裸小鼠最顯著的表型是皮膚被毛異常,關(guān)注于這一表型可以將裸小鼠用于皮膚或毛發(fā)發(fā)育相關(guān)的研究,但是如果錯失了其胸腺缺失免疫缺陷這一表型,將是對這一模型資源的極大浪費。因此,在本研究中,我們將通過生理生化指標的測定和行為學相關(guān)的實驗來分析NIH 稀毛小鼠的相關(guān)生物學特性,完善其基礎(chǔ)信息,為實驗動物資源的開發(fā)和模型的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物

        6 ~8 周齡的NIH 稀毛小鼠由吉林大學實驗動物中心提供,SPF 級6 ~8 周齡的NIH 小鼠購于長春生物制品有限公司,所有動物均飼養(yǎng)于吉林大學實驗動物中心,自由采食飲水,光暗周期12 h/12 h,所有操作符合實驗動物倫理福利規(guī)范的要求,具體實驗動物的分組和數(shù)量見各部分實驗設(shè)計,NIH 小鼠以NIH 表示,NIH 稀毛小鼠以HL 表示。

        1.2 主要試劑和儀器

        75%乙醇、英雄牌黑墨水、桂龍牌黃帽帶分離膠促凝血液采集管、富士干式生化儀、超凈工作臺、離心機、行為學配套設(shè)備及分析軟件。

        1.3 血清生化指標的測定

        8周齡雄性NIH稀毛小鼠和NIH小鼠各10只(雄性小鼠適應(yīng)性強,狀態(tài)穩(wěn)定,自身激素影響較小,常用于臟器功能性實驗),摘眼球采血收集于黃帽采集管,4 000 rpm 離心15 min 收集上清液,使用生化儀上機檢測生化21 項指標。

        1.4 開放曠場實驗

        在60 cm(長)× 60 cm(寬)× 40 cm(高)的非透明無毒材質(zhì)曠場中進行試驗。整個場地劃分為4×4 共16 個正方形小塊,中間4 個正方形區(qū)域為內(nèi)區(qū)。開始攝像,選擇一個壁,然后輕輕地將鼠面壁由中點位置放入,記錄5 min 的運動軌跡。隨后使用蒸餾水和75%乙醇擦拭清潔實驗場地,防止排泄物及殘留氣味影響后續(xù)實驗。重復(fù)以上步驟,直到所有小鼠完成實驗。觀察記錄三個指標:總的運動距離、內(nèi)區(qū)占比、內(nèi)區(qū)穿越次數(shù)。

        1.5 新物體識別實驗

        實驗所用場地同上,新物體識別實驗包含三個部分:第一部分習慣場地(1.4 中已完成),第二部分熟悉舊物體,第三部分測試新物體識別情況。第二部分實驗使用5 cm(長)×5 cm(寬)×8 cm(高)的兩個紅色正方體積木作為舊物體,兩個積木通過雙面膠固定離壁5 cm 處,面向壁側(cè)中央放入小鼠探索活動5 min。第二部分實驗結(jié)束后3 h 進行第三部分,實驗時將其中一塊紅色正方體積木更換為黃色球體積木,直徑5 cm,同樣探索活動5 min,記錄小鼠探索新物體和舊物體的實驗占比。實驗設(shè)置為以小鼠鼻尖距物體2 cm 內(nèi)視為對物體有探索行為。

        1.6 高架十字迷宮實驗

        在所有小鼠進行新物體識別實驗的后一天進行高架十字迷宮試驗,按照步驟1.6 所述清潔儀器。注:高架迷宮的結(jié)構(gòu)為“十”形。它有兩個張開的手臂(30 cm×5 cm×0.5 cm),彼此交叉,垂直于兩個閉合的手臂(30 cm×5 cm×16 cm),中間有一個平臺(5 cm×5 cm×0.5 cm)。迷宮高出地面40 cm。將小鼠放開臂和閉臂的交界處,記錄5 min的探索行為。觀察記錄小鼠在張開臂(open)和閉合臂(close)中的時間,open/close 表示焦慮程度,記錄活動軌跡圖。

        1.7 Morris 水迷宮實驗

        實驗所用場地為直徑120 cm、高60 cm 的圓形水池,等分為四個象限。實驗前一天清洗水池并注水,加入6 mL 黑墨水增強小鼠與背景反差,設(shè)置儀器參數(shù)。首先進行可視化平臺實驗,即目標平臺高于水面在小鼠視野范圍內(nèi),該實驗結(jié)果將反應(yīng)小鼠的視力和游動速度對后續(xù)實驗的影響;其次進行定向航行實驗訓(xùn)練小鼠尋找目標平臺,此時目標平臺在水下1 cm 處,小鼠無法直接觀察到,實驗結(jié)果反應(yīng)小鼠的學習能力,該部分實驗為期4 d,每天訓(xùn)練4 次,每次由不同象限入水;最后進行空間探索實驗,將目標平臺撤離,小鼠由對側(cè)象限入水,觀察小鼠在目標平臺所在象限的停留時間,穿梭進入目標平臺的次數(shù)等,實驗結(jié)果反應(yīng)小鼠的空間記憶能力。

        1.8 統(tǒng)計分析

        使用Graphpad Prism 軟件(8.2.1 版本)進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和繪圖展示,實驗結(jié)果以平均值±標準差表示,組間比較采用雙尾T 檢驗,*表示p<0.05、**表示p<0.01。

        2 結(jié)果

        2.1 NIH 稀毛小鼠血清生化指標的檢測結(jié)果

        血清生化指標主要包括肝功能、腎功能、血脂、血糖等指標,能夠反應(yīng)肝臟腎臟的基本狀態(tài)。檢測結(jié)果表明,相較于NIH 小鼠,NIH 稀毛小鼠肝功相關(guān)的的ALT、AST 和D-BIL 顯著升高(p<0.05),CHE、TP 和ALB 顯著升高(p<0.0001),ALP 顯著降低(p<0.01);腎功相關(guān)的BUN 降低(p<0.05),AU 升 高(p<0.01);血 脂 相 關(guān) 的TG 顯 著 升 高(p<0.05)。結(jié)果指示NIH 稀毛小鼠的肝功和腎功存在異常。相關(guān)結(jié)果見表1。

        表1 8 周齡雄性NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠血清生化指標

        2.2 開放曠場實驗結(jié)果

        曠場實驗通過觀察小鼠在場地中間區(qū)域和外周曲線的活動情況,基于運動距離,穿梭次數(shù)和停留時間等指標來評價受試物在新異環(huán)境中的活動量和探索情況。5 min 的曠場實驗結(jié)果表明,NIH 稀毛小鼠(HL)與NIH 小鼠(NIH)在活動量上無明顯區(qū)別(圖1A);但是通過對小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動時間(圖1B)和穿入次數(shù)(圖1C)進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),NIH 稀毛小鼠相較于NIH 小鼠具有更強的探索行為。

        2.3 新物體識別實驗和高架十字迷宮實驗結(jié)果

        新物體識別實驗通過設(shè)置顏色及性狀各異的兩類探索物,基于小鼠對新異食物的探索偏好度來反應(yīng)小鼠的短時記憶。實驗結(jié)果表明,在5 min 的測試時間中,兩種小鼠的新物體識別能力無明顯區(qū)別(圖2A);高架十字迷宮則是通過設(shè)置敞臂和開臂兩種探索區(qū)域來測定小鼠的焦慮樣表現(xiàn)。實驗結(jié)果表明,NIH 稀毛小鼠有明顯的焦慮樣行為,具體表現(xiàn)為開閉壁探索比例顯著低于NIH 小鼠(p<0.0001)(圖2B),運動軌跡圖直接展示了小鼠的探索活動行為(圖2C、D)。

        圖1 OFT 實驗結(jié)果

        圖2 NOR 實驗和EPM 實驗結(jié)果

        2.4 Morris 水迷宮實驗結(jié)果

        Morris 水迷宮實驗包含兩個階段的內(nèi)容,能夠?qū)游锏膶W習能力和空間記憶能力進行評價。首先將目標平臺置于水面之上進行可視化平臺測試,結(jié)果表明兩組小鼠的視力正常并且游動速度不會影響實驗結(jié)果(圖3A);為期4 d 的定向航行實驗訓(xùn)練小鼠尋找隱藏的平臺,結(jié)果表明隨著訓(xùn)練的進行兩組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短,但兩組之間無明顯區(qū)別(圖3);圖3C、D 展示了訓(xùn)練第4 天兩組小鼠的運動軌跡。

        圖3 Morris 水迷宮定向航行實驗

        第5 天撤去隱藏平臺進行空間探索實驗,小鼠由目標象限對側(cè)入水(圖中右上角圓點表示入水點,下半?yún)^(qū)域圓點表示實驗結(jié)束時小鼠的停留位置),在測試時間60 s 中NIH 稀毛小鼠進入目標象限的次數(shù)顯著多于NIH 小鼠(圖4A),在目標象限的停留時間比例也顯著高于NIH 小鼠(圖4B),表明NIH 稀毛小鼠的空間記憶能力強于NIH 小鼠。圖4C、D 展示兩組小鼠的運動軌跡。

        圖4 Morris 水迷宮空間探索實驗

        3 討論

        小鼠模型是生命科學和醫(yī)學研究中最常使用的模型。被毛突變小鼠是其中的一種,在皮膚光老化、毛發(fā)生長周期的調(diào)控機制、腫瘤、感染和免疫方面有著廣泛的應(yīng)用。NIH 稀毛小鼠是一種自發(fā)性的被毛突變鼠,前期的研究表明其毛囊形態(tài)發(fā)生和周期循環(huán)存在異常,取雌性42 日齡NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠的背部皮膚進行了轉(zhuǎn)錄組測序,構(gòu)建了差異基因表達譜,NIH 稀毛小鼠可以用于毛囊發(fā)育相關(guān)的研究。皮膚是機體免疫的第一道屏障,毛囊的異常影響皮膚穩(wěn)態(tài),通過單增李斯特桿菌感染實驗對NIH 稀毛小鼠的先天免疫能力進行了測定,評估了了腸道菌群對實驗結(jié)果的影響,表明NIH 稀毛小鼠有用于免疫、腫瘤研究的潛力。

        為了進一步完善NIH 稀毛小鼠的生物學特性,加深對這一新型實驗動物模型的認識,在本研究中對NIH 稀毛小鼠的生理生化指標和行為學相關(guān)的生物學特性進行了測定和分析。結(jié)果表明,NIH 稀毛小鼠的肝功異常,可以嘗試將NIH 稀毛小鼠用于肝炎、肝損傷模型的研究。通過曠場實驗、新物體識別實驗、高架十字迷宮實驗和Morris 水迷宮實驗對NIH 稀毛小鼠的活動量、記憶、探索和焦慮行為進行了測定分析,結(jié)果表明NIH 稀毛小鼠的空間記憶能力增強,探索行為增強但是呈現(xiàn)出對高懸開臂的恐懼樣的焦慮行為,NIH 稀毛小鼠在行為學方面的特性提示其可能適合應(yīng)用于記憶焦慮相關(guān)的藥理或毒理實驗。

        此外,NIH 稀毛小鼠是一種自發(fā)突變鼠,遺傳學實驗表明這是一種常染色體單基因隱性突變,通過全基因組重測序?qū)⑼蛔兓蚨ㄎ坏搅?4 號染色體,對NIH 稀毛小鼠表型的分析將揭示突變基因的潛在功能,為后期突變基因的精細定位和驗證提供了有利支撐。

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