冀中豪，于小亞，任文陟，陳 健，胡進(jìn)平*

1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，山西長(zhǎng)治 046000；2.吉林省科技創(chuàng)新平臺(tái)管理中心，吉林長(zhǎng)春 130062；3.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062；

實(shí)驗(yàn)小鼠是最常使用的一種模式動(dòng)物，在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著巨大的作用。NIH 稀毛小鼠是被毛異常的自發(fā)突變鼠，其背景品系是封閉群NIH 小鼠，為常染色體隱性遺傳。毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育包括形態(tài)發(fā)生和周期循環(huán)兩個(gè)階段，目前研究發(fā)現(xiàn)的多種被毛突變小鼠模型主要表現(xiàn)為周期循環(huán)階段的異常，例如典型的Hr 基因突變小鼠表現(xiàn)為漸進(jìn)性脫毛，而NIH 稀毛小鼠屬于形態(tài)發(fā)生期存在異常表現(xiàn)為出生后一直保持稀毛甚至無(wú)毛的狀態(tài)。前期研究中對(duì)NIH 稀毛小鼠的皮膚結(jié)構(gòu)和免疫相關(guān)的生物學(xué)特性進(jìn)行了觀察和測(cè)定，發(fā)現(xiàn)NIH 稀毛小鼠表皮層增厚、毛發(fā)周期轉(zhuǎn)換異常，單增李斯特桿菌感染實(shí)驗(yàn)表明相較于NIH 小鼠其免疫力降低。

使用最廣泛的一種被毛異常小鼠是裸小鼠，其胸腺缺失T 細(xì)胞缺陷而導(dǎo)致的免疫低下使其適用于腫瘤、免疫和感染等相關(guān)方向的研究。裸小鼠最顯著的表型是皮膚被毛異常，關(guān)注于這一表型可以將裸小鼠用于皮膚或毛發(fā)發(fā)育相關(guān)的研究，但是如果錯(cuò)失了其胸腺缺失免疫缺陷這一表型，將是對(duì)這一模型資源的極大浪費(fèi)。因此，在本研究中，我們將通過(guò)生理生化指標(biāo)的測(cè)定和行為學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)來(lái)分析NIH 稀毛小鼠的相關(guān)生物學(xué)特性，完善其基礎(chǔ)信息，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源的開(kāi)發(fā)和模型的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 ～8 周齡的NIH 稀毛小鼠由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF 級(jí)6 ～8 周齡的NIH 小鼠購(gòu)于長(zhǎng)春生物制品有限公司，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由采食飲水，光暗周期12 h/12 h，所有操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利規(guī)范的要求，具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和數(shù)量見(jiàn)各部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，NIH 小鼠以NIH 表示，NIH 稀毛小鼠以HL 表示。

1.2 主要試劑和儀器

75%乙醇、英雄牌黑墨水、桂龍牌黃帽帶分離膠促凝血液采集管、富士干式生化儀、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、行為學(xué)配套設(shè)備及分析軟件。

1.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

8周齡雄性NIH稀毛小鼠和NIH小鼠各10只(雄性小鼠適應(yīng)性強(qiáng)，狀態(tài)穩(wěn)定，自身激素影響較小，常用于臟器功能性實(shí)驗(yàn))，摘眼球采血收集于黃帽采集管，4 000 rpm 離心15 min 收集上清液，使用生化儀上機(jī)檢測(cè)生化21 項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 開(kāi)放曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

在60 cm（長(zhǎng)）× 60 cm（寬）× 40 cm（高）的非透明無(wú)毒材質(zhì)曠場(chǎng)中進(jìn)行試驗(yàn)。整個(gè)場(chǎng)地劃分為4×4 共16 個(gè)正方形小塊，中間4 個(gè)正方形區(qū)域?yàn)閮?nèi)區(qū)。開(kāi)始攝像，選擇一個(gè)壁，然后輕輕地將鼠面壁由中點(diǎn)位置放入，記錄5 min 的運(yùn)動(dòng)軌跡。隨后使用蒸餾水和75%乙醇擦拭清潔實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，防止排泄物及殘留氣味影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。重復(fù)以上步驟，直到所有小鼠完成實(shí)驗(yàn)。觀察記錄三個(gè)指標(biāo)：總的運(yùn)動(dòng)距離、內(nèi)區(qū)占比、內(nèi)區(qū)穿越次數(shù)。

1.5 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用場(chǎng)地同上，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)包含三個(gè)部分：第一部分習(xí)慣場(chǎng)地（1.4 中已完成），第二部分熟悉舊物體，第三部分測(cè)試新物體識(shí)別情況。第二部分實(shí)驗(yàn)使用5 cm（長(zhǎng)）×5 cm（寬）×8 cm（高）的兩個(gè)紅色正方體積木作為舊物體，兩個(gè)積木通過(guò)雙面膠固定離壁5 cm 處，面向壁側(cè)中央放入小鼠探索活動(dòng)5 min。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)束后3 h 進(jìn)行第三部分，實(shí)驗(yàn)時(shí)將其中一塊紅色正方體積木更換為黃色球體積木，直徑5 cm，同樣探索活動(dòng)5 min，記錄小鼠探索新物體和舊物體的實(shí)驗(yàn)占比。實(shí)驗(yàn)設(shè)置為以小鼠鼻尖距物體2 cm 內(nèi)視為對(duì)物體有探索行為。

1.6 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

在所有小鼠進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的后一天進(jìn)行高架十字迷宮試驗(yàn)，按照步驟1.6 所述清潔儀器。注：高架迷宮的結(jié)構(gòu)為“十”形。它有兩個(gè)張開(kāi)的手臂（30 cm×5 cm×0.5 cm），彼此交叉，垂直于兩個(gè)閉合的手臂（30 cm×5 cm×16 cm），中間有一個(gè)平臺(tái)（5 cm×5 cm×0.5 cm）。迷宮高出地面40 cm。將小鼠放開(kāi)臂和閉臂的交界處，記錄5 min的探索行為。觀察記錄小鼠在張開(kāi)臂（open）和閉合臂（close）中的時(shí)間，open/close 表示焦慮程度，記錄活動(dòng)軌跡圖。

1.7 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用場(chǎng)地為直徑120 cm、高60 cm 的圓形水池，等分為四個(gè)象限。實(shí)驗(yàn)前一天清洗水池并注水，加入6 mL 黑墨水增強(qiáng)小鼠與背景反差，設(shè)置儀器參數(shù)。首先進(jìn)行可視化平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，即目標(biāo)平臺(tái)高于水面在小鼠視野范圍內(nèi)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果將反應(yīng)小鼠的視力和游動(dòng)速度對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響；其次進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練小鼠尋找目標(biāo)平臺(tái)，此時(shí)目標(biāo)平臺(tái)在水下1 cm 處，小鼠無(wú)法直接觀察到，實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)小鼠的學(xué)習(xí)能力，該部分實(shí)驗(yàn)為期4 d，每天訓(xùn)練4 次，每次由不同象限入水；最后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將目標(biāo)平臺(tái)撤離，小鼠由對(duì)側(cè)象限入水，觀察小鼠在目標(biāo)平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間，穿梭進(jìn)入目標(biāo)平臺(tái)的次數(shù)等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)小鼠的空間記憶能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad Prism 軟件（8.2.1 版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和繪圖展示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用雙尾T 檢驗(yàn)，*表示p＜0.05、**表示p＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 NIH 稀毛小鼠血清生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

血清生化指標(biāo)主要包括肝功能、腎功能、血脂、血糖等指標(biāo)，能夠反應(yīng)肝臟腎臟的基本狀態(tài)。檢測(cè)結(jié)果表明，相較于NIH 小鼠，NIH 稀毛小鼠肝功相關(guān)的的ALT、AST 和D-BIL 顯著升高（p＜0.05），CHE、TP 和ALB 顯著升高（p＜0.0001），ALP 顯著降低（p＜0.01）；腎功相關(guān)的BUN 降低（p＜0.05），AU 升 高（p＜0.01）；血 脂 相 關(guān) 的TG 顯 著 升 高（p＜0.05）。結(jié)果指示NIH 稀毛小鼠的肝功和腎功存在異常。相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8 周齡雄性NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠血清生化指標(biāo)

2.2 開(kāi)放曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察小鼠在場(chǎng)地中間區(qū)域和外周曲線的活動(dòng)情況，基于運(yùn)動(dòng)距離，穿梭次數(shù)和停留時(shí)間等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)受試物在新異環(huán)境中的活動(dòng)量和探索情況。5 min 的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NIH 稀毛小鼠（HL）與NIH 小鼠（NIH）在活動(dòng)量上無(wú)明顯區(qū)別（圖1A）；但是通過(guò)對(duì)小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)時(shí)間（圖1B）和穿入次數(shù)（圖1C）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，NIH 稀毛小鼠相較于NIH 小鼠具有更強(qiáng)的探索行為。

2.3 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)置顏色及性狀各異的兩類探索物，基于小鼠對(duì)新異食物的探索偏好度來(lái)反應(yīng)小鼠的短時(shí)記憶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在5 min 的測(cè)試時(shí)間中，兩種小鼠的新物體識(shí)別能力無(wú)明顯區(qū)別（圖2A）；高架十字迷宮則是通過(guò)設(shè)置敞臂和開(kāi)臂兩種探索區(qū)域來(lái)測(cè)定小鼠的焦慮樣表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NIH 稀毛小鼠有明顯的焦慮樣行為，具體表現(xiàn)為開(kāi)閉壁探索比例顯著低于NIH 小鼠（p＜0.0001）（圖2B），運(yùn)動(dòng)軌跡圖直接展示了小鼠的探索活動(dòng)行為（圖2C、D）。

圖1 OFT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 NOR 實(shí)驗(yàn)和EPM 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)包含兩個(gè)階段的內(nèi)容，能夠?qū)?dòng)物的學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先將目標(biāo)平臺(tái)置于水面之上進(jìn)行可視化平臺(tái)測(cè)試，結(jié)果表明兩組小鼠的視力正常并且游動(dòng)速度不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3A）；為期4 d 的定向航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練小鼠尋找隱藏的平臺(tái)，結(jié)果表明隨著訓(xùn)練的進(jìn)行兩組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，但兩組之間無(wú)明顯區(qū)別（圖3）；圖3C、D 展示了訓(xùn)練第4 天兩組小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。

圖3 Morris 水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)

第5 天撤去隱藏平臺(tái)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，小鼠由目標(biāo)象限對(duì)側(cè)入水（圖中右上角圓點(diǎn)表示入水點(diǎn)，下半?yún)^(qū)域圓點(diǎn)表示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠的停留位置），在測(cè)試時(shí)間60 s 中NIH 稀毛小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)顯著多于NIH 小鼠（圖4A），在目標(biāo)象限的停留時(shí)間比例也顯著高于NIH 小鼠（圖4B），表明NIH 稀毛小鼠的空間記憶能力強(qiáng)于NIH 小鼠。圖4C、D 展示兩組小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。

圖4 Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)

3 討論

小鼠模型是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中最常使用的模型。被毛突變小鼠是其中的一種，在皮膚光老化、毛發(fā)生長(zhǎng)周期的調(diào)控機(jī)制、腫瘤、感染和免疫方面有著廣泛的應(yīng)用。NIH 稀毛小鼠是一種自發(fā)性的被毛突變鼠，前期的研究表明其毛囊形態(tài)發(fā)生和周期循環(huán)存在異常，取雌性42 日齡NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠的背部皮膚進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建了差異基因表達(dá)譜，NIH 稀毛小鼠可以用于毛囊發(fā)育相關(guān)的研究。皮膚是機(jī)體免疫的第一道屏障，毛囊的異常影響皮膚穩(wěn)態(tài)，通過(guò)單增李斯特桿菌感染實(shí)驗(yàn)對(duì)NIH 稀毛小鼠的先天免疫能力進(jìn)行了測(cè)定，評(píng)估了了腸道菌群對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，表明NIH 稀毛小鼠有用于免疫、腫瘤研究的潛力。

為了進(jìn)一步完善NIH 稀毛小鼠的生物學(xué)特性，加深對(duì)這一新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的認(rèn)識(shí)，在本研究中對(duì)NIH 稀毛小鼠的生理生化指標(biāo)和行為學(xué)相關(guān)的生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定和分析。結(jié)果表明，NIH 稀毛小鼠的肝功異常，可以嘗試將NIH 稀毛小鼠用于肝炎、肝損傷模型的研究。通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)NIH 稀毛小鼠的活動(dòng)量、記憶、探索和焦慮行為進(jìn)行了測(cè)定分析，結(jié)果表明NIH 稀毛小鼠的空間記憶能力增強(qiáng)，探索行為增強(qiáng)但是呈現(xiàn)出對(duì)高懸開(kāi)臂的恐懼樣的焦慮行為，NIH 稀毛小鼠在行為學(xué)方面的特性提示其可能適合應(yīng)用于記憶焦慮相關(guān)的藥理或毒理實(shí)驗(yàn)。

此外，NIH 稀毛小鼠是一種自發(fā)突變鼠，遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)表明這是一種常染色體單基因隱性突變，通過(guò)全基因組重測(cè)序?qū)⑼蛔兓蚨ㄎ坏搅?4 號(hào)染色體，對(duì)NIH 稀毛小鼠表型的分析將揭示突變基因的潛在功能，為后期突變基因的精細(xì)定位和驗(yàn)證提供了有利支撐。