許 皓，劉建榮，王力欣，欒 楊，任 飛，王 崢，丁尚紅

吉林特研生物技術(shù)有限責任公司, 吉林長春 130122

肺炎克雷伯氏菌既是一種可以引起多種動物患病的條件性致病菌，又是一種人獸共患病病原。在自然界、人和動物體內(nèi)廣泛存在。當水貂換毛抵抗力下降或本菌大量增殖時，會引起水貂發(fā)病甚至爆發(fā)性流行。肺炎克雷伯氏菌為革蘭氏染色陰性，臨床新分離的菌株有較厚的莢膜，多數(shù)菌株有菌毛，無鞭毛和芽孢；營養(yǎng)要求不高，兼性厭氧；在普通培養(yǎng)基上生長成黏液狀大菌落，容易相互融合，易拉成絲。近年養(yǎng)殖環(huán)境污染嚴重、養(yǎng)殖密度大導(dǎo)致本病發(fā)病率逐年上升，山東省、遼寧省等地本病例較多，常常導(dǎo)致水貂呼吸困難及其他化膿性炎癥，發(fā)病率高，死亡率低，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失。本文對2013 ～2016 年不同省份病料的采集，進行了細菌分離鑒定和相關(guān)實驗，結(jié)果表明肺炎克雷伯氏菌K2 是最流行的血清型，是導(dǎo)致養(yǎng)殖場大規(guī)模死亡的原因。

1 材料

1.1 菌株

肺炎克雷伯氏菌標準菌株ATCC700603 均購自杭州天和微生物試劑有限責任公司。

1.2 試驗動物

900 只18 ～20 日齡SPF 級ICR 小鼠）購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司。

1.3 試劑

胰蛋白大豆瓊脂、胰蛋白大豆肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；PCR 反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq ? 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；綠膿桿菌分型血清購自日本生研株式會社；生化鑒定管、藥敏片購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.4 主要儀器

超凈工作臺購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備公司；空氣恒溫搖床購自上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；PCR 儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；電熱恒溫水槽購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；隔水式培養(yǎng)箱購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；光學(xué)正置顯微鏡購自卡爾蔡司公司。

2 方法

2.1 病料采集與細菌分離

423 份病料樣品來自2013 ～2016 年山東省、河北省、黑龍江省、吉林省的82 個水貂群，包括大、中、小型養(yǎng)殖場和各種類型的農(nóng)村散養(yǎng)戶。發(fā)病水貂多表現(xiàn)為呼吸困難、鼻孔流血、突發(fā)性死亡等癥狀。采集患病水貂肺組織，用無菌剪刀在肺組織剪開一個切口，將接種環(huán)深入切口內(nèi)取樣，劃線接種于TSA 平板，37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h 后觀察，挑取各種優(yōu)勢菌落傳代純化。

2.2 細菌培養(yǎng)

細菌的分離培養(yǎng)與菌落、菌體形態(tài)觀察。將采集的肺臟病料組織劃線接種于TSA 平板上，37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h 后挑取疑似菌落進行傳代純化，再培養(yǎng)18 ～24 h 后觀察菌落形態(tài)。同時，分別挑取3 ～5 個單菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)特征。

2.3 細菌PCR 鑒定

2.3.1 PCR 引物

采用通用引物擴增16SrRNA 基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按文獻（Lin et al., 2014）和(Turton et al., 2010)報道的肺炎克雷伯氏菌血清型特異性引物序列，合成引物，對疑似的肺炎克雷伯氏菌菌株進行PCR 鑒定及分型。本實驗所用PCR 引物詳見表1。

2.3.2 模板的制備

用擴增的純化菌液，取1 mL 加入1.5 mL 離心管中，以10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入100 μL ddH20 混勻，置沸水中煮沸15 min，再以12 000r/min 離心15 min，取上清液即為模板。

2.3.3 PCR 擴增

細菌分離鑒定PCR 反應(yīng)體系（40 μL）：PCR 反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq ?20 μL，無菌水18 μL，10 pmol/L 上、下游引物各0.5 μL，細菌基因組模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；30 個循環(huán)，94 ℃變性40 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，降溫至4 ℃保存。肺炎克雷伯氏菌分型PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：PCR 反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq ?12.5 μL，無菌水10.5 μL，10 pmol/L 上、下游引物各0.5 μL，細菌基因組模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min；30 個循環(huán)，94 ℃變性40 s、59 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s，30 個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，后降溫至4 ℃保存。

PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上120 V 電泳分離25 min，核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)照相后觀察分析。肺炎克雷伯氏菌的PCR 產(chǎn)物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，并對測序結(jié)果應(yīng)用在線生物學(xué)軟件Standard Nucleotide BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行NCBI 數(shù)據(jù)庫搜索比對分析。

表1 本試驗所用PCR 引物

2.4 肺炎克雷伯氏菌的小鼠毒力試驗

對35 株K2 型肺炎克雷伯氏菌進行了小鼠半數(shù)致死劑量（50% Lethal Dose, LD50）的測定。

2.5 生化鑒定

采用細菌生化鑒定管對純培養(yǎng)物進行生化鑒定，接種后的發(fā)酵管置于隔水式培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18 ～24 h，統(tǒng)計生化試驗結(jié)果。

2.6 藥敏試驗

按照K-B 紙片擴散法進行藥敏試驗及結(jié)果的判斷。

3 結(jié)果

3.1 細菌的形態(tài)與培養(yǎng)特性

肺炎克雷伯氏菌在培養(yǎng)基上形成淺白色半透明，圓形凸起，邊緣齊整的光滑型菌落，挑取時牽拉成絲。革蘭染色鏡檢，分離菌株為革蘭氏陰性桿菌，莢膜明顯，無芽孢，菌體兩端頓圓，單個散在，少數(shù)菌體兩兩相連，中等大小粗短桿菌（見圖1）。

3.2 PCR 鑒定結(jié)果

對分離菌株16SrRNA 基因進行擴增，均擴增出大小為1 445 bp 的DNA 條帶（見圖2）。將分離菌株所測16SrRNA 基因序列與GenBank 中已收錄核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索，經(jīng)比對后確定菌株為肺炎克雷伯氏菌，與登錄號為CP054268.1 的肺炎克雷伯氏菌16SrRNA 序列同源性為99%。

圖1 肺炎克雷伯氏菌菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)

3.3 肺炎克雷伯氏菌分離鑒定及分型結(jié)果

通過PCR 分型方法對68 株肺炎克雷伯氏菌進行了血清型鑒定，擴增出641 bp 的片段（見圖3）。將分離菌株所測基因序列與GenBank 中已收錄核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索，經(jīng)比對后確定菌株為K2型肺炎克雷伯氏菌，與登錄號為AB362367.1 的K2型肺炎克雷伯氏菌序列同源性為99%。

3.4 K2 型肺炎克雷伯氏菌的小鼠毒力試驗結(jié)果

根據(jù)Reed-Muench 法計算35 株菌株的小鼠半數(shù)致死劑量（LD50）（見表2），結(jié)果表明，35 株K2 型肺炎克雷伯氏菌的LD50介于0.9×102～2.0×108CFU，其中有一株菌株在小鼠毒力試驗中表現(xiàn)為超強毒株，其LD50為0.9×102CFU。根據(jù)對35 株肺炎克雷伯氏菌的小鼠毒力試驗結(jié)果，篩選出小鼠毒力試驗中表現(xiàn)毒力最強的4 株肺炎克雷伯氏菌，分別為5 號菌株、14 號菌株、20 號菌株、27 號菌株，進行后續(xù)生化試驗及藥敏試驗。

3.5 生化鑒定

生化試驗結(jié)果（見表3）表明，4 株K2 型肺炎克雷伯氏菌株的氧化酶、硫化氫H2S、鳥氨酸、甲基紅、動力試驗鑒定結(jié)果均為陰性；靛基質(zhì)、尿素、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖試驗鑒定結(jié)果均為陽性；苯丙氨酸、賴氨酸、枸櫞酸鹽試驗結(jié)果存在差異，同一血清型的不同菌株之間也存在明顯差異。

3.6 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果（表4）表明，4 株肺炎克雷伯氏菌強毒菌株對氧氟沙星、阿米卡星為敏感或介于中間；對強力霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素、林可霉素、新霉素、多粘菌素B 均耐藥；對諾氟沙星、慶大霉素、青霉素G、四環(huán)素均為耐藥或介于中間。

表2 K2 型肺炎克雷伯氏菌的小鼠毒力試驗結(jié)果

表3 肺炎克雷伯氏菌生化鑒定結(jié)果

表4 4 株肺炎克雷伯氏菌藥敏試驗結(jié)果

4 討論

肺炎克雷伯氏菌對水貂的致病力往往是致死性的，造成水貂嚴重的出血性肺炎。有報道對6 個地區(qū)18 個規(guī)?；游镳B(yǎng)殖場進行流行病學(xué)調(diào)查及對送檢的病料樣品進行病原學(xué)檢查，67.2 %～81.5%的被檢病料樣品中存在肺炎克雷伯氏菌，同時肺炎克雷伯氏菌引起水貂發(fā)病的報道也逐漸增多。近年來，我國山東、河北、黑龍江、吉林等主要的水貂養(yǎng)殖地區(qū)持續(xù)暴發(fā)流行水貂出血性肺炎，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失，已經(jīng)成為危害我國水貂養(yǎng)殖業(yè)的重大傳染病之一。根據(jù)莢膜多糖（K抗原）分型，可將肺炎克雷伯菌分為82 個K 血清型，相比其他血清型，K1、K2、K54 和K57 型為強毒力菌株，其中以K2 型的毒力最強。本研究對山東省等四個省份開展了大規(guī)模水貂肺炎克雷伯氏菌分離鑒定及PCR 血清型分型，分離到35 株K2 型肺炎克雷伯氏菌，進一步表明K2 型是主要的血清型。通過小鼠毒力試驗選出3 株毒力較強的菌株，1 株超強的菌株，并對這4 株菌株進行了生化試驗及藥敏試驗，結(jié)果表明肺炎克雷伯氏菌一種血清型4 個菌株的氧化酶、硫化氫H2S、鳥氨酸、甲基紅、動力試驗鑒定結(jié)果均為陰性；靛基質(zhì)、尿素、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖試驗鑒定結(jié)果均為陽性；苯丙氨酸、賴氨酸、枸櫞酸鹽試驗結(jié)果存在差異，同一血清型的不同菌株之間也存在明顯差異；藥敏試驗結(jié)果表明，4 株肺炎克雷伯氏菌強毒菌株對氧氟沙星、阿米卡星為敏感或介于中間；對強力霉素、環(huán)丙沙星等8 種抗生素均耐藥；對諾氟沙星、慶大霉素等4 種抗生素均為耐藥或介于中間，這可能與養(yǎng)殖場大量不合理地使用抗生素有關(guān)，還可能與肺炎克雷伯氏菌攜帶毒力基因有關(guān)，有待進一步研究。

本研究對所分離到菌株的菌體形態(tài)、血清型、生化特性、藥物敏感性等生物學(xué)特性進行了系統(tǒng)鑒定，為進一步客觀評估水貂出血性肺炎的危害及其綜合防控提供參考依據(jù)。

參考文獻：略