陳天鵬 何才劍 房謀昊 周航 唐彬彬 劉康 梁博程 毛應(yīng)德龍 郄鳳卿 史曉林*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000 2.浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310000 3.東京癒心健康研究所，日本 東京

骨質(zhì)疏松患者由于其骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加而導(dǎo)致骨折風(fēng)險大大升高[1]。在50歲以后的骨質(zhì)疏松患者中，每過10年骨折的概率就增加1倍[2]。骨質(zhì)疏松骨折主要發(fā)生于髖部、椎體、橈骨遠(yuǎn)端、肱骨[3]。目前，關(guān)于骨質(zhì)疏松椎體骨折的研究取得了重大進(jìn)展，而非椎體骨折的研究進(jìn)展相對落后[4]。但就骨質(zhì)疏松患者骨折的發(fā)病概率、死亡率，和給患者造成的經(jīng)濟(jì)損失和痛苦而言，非椎體骨折遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于椎體骨折，其中尤其是髖部骨折更為顯著[5]?，F(xiàn)在臨床上使用的抗骨質(zhì)疏松藥物，對非椎體骨折風(fēng)險的預(yù)防作用也往往弱于椎體骨折[6]。椎體骨折主要是因?yàn)樗少|(zhì)骨含量減少，而非椎體骨折主要原因以皮質(zhì)骨變薄或變脆引起的[7]?；谶@些差異，我們推測，抗骨質(zhì)疏松藥物在皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨作用可能不一致。皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)所涉及的信號通路可能有所差別。關(guān)于Pyle綜合癥的研究證實(shí)了這種猜測，在Pyle綜合癥患者中，干骺端骨小梁均勻但骨干部皮質(zhì)骨明顯減少[8]。

1 WNT信號通路對骨質(zhì)疏松的影響

WNT信號通路在骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用[9]。在經(jīng)典WNT信號通路中，WNT配體通過激活β-catenin信號，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子osterix的表達(dá)，從而促進(jìn)骨形成。與此同時，該信號增加了骨保護(hù)素(OPG)的形成，抑制骨吸收[10]。在非經(jīng)典WNT信號通路中，WNT5a通過鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II-TGF-β激活的激酶1-Nemo樣激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了共阻遏物復(fù)合物的Ppar-γ反式激活，并誘導(dǎo)了Runx2的表達(dá)，從而促進(jìn)了成骨細(xì)胞生成[11]。最近一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)立于β-catenin信號的另一非經(jīng)典WNT信號通路 ——WNT16。WNT16是家族中的一員，主要表達(dá)在皮質(zhì)骨和骨膜中[12]。研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞分泌的WNT16能直接作用于破骨細(xì)胞的RANK受體，干擾RANKL與RANK受體的結(jié)合而抑制破骨細(xì)胞分化。另一方面，WNT16通過促進(jìn)成骨細(xì)胞骨保護(hù)素的生成，競爭性抑制RANKL與RANK受體的結(jié)合而抑制皮質(zhì)骨上的骨吸收[13]。

注：WNT16可抑制破骨細(xì)胞Rank受體表達(dá)及干擾Rank受體與Rankl的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞分化成熟。WNT16還能通過OPG的表達(dá)間接的抑制破骨細(xì)胞分化。圖1 WNT信號通路對骨質(zhì)疏松的影響Fig.1 The influence of Wnt signaling pathway on osteoporosis

2 WNT16增加皮質(zhì)骨強(qiáng)度

皮質(zhì)骨的脆性增加是造成骨質(zhì)疏松性非椎骨骨折的主要因素，但對皮質(zhì)厚度與密度的調(diào)控機(jī)制知之甚少[14]。在Ohlsson等[15]對WNT16失活小鼠模型的研究中表明，WNT16失活小鼠對比對照組小鼠，骨皮質(zhì)厚度明顯下降(P>0.05)。皮質(zhì)骨厚度減少是由骨吸收增加和骨膜減少形成所致。這表明，WNT16是在骨皮質(zhì)生長發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是皮質(zhì)骨厚度和非椎體骨折的主要決定因素。因此，WNT16可能成為預(yù)防骨質(zhì)疏松非椎體骨折的關(guān)鍵靶點(diǎn)。針對WNT16這一預(yù)防骨質(zhì)疏松非椎體骨折的潛在靶點(diǎn)，通過他莫昔芬誘導(dǎo)小鼠WNT16高表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了WNT16在骨穩(wěn)態(tài)中所起的作用。他們發(fā)現(xiàn)，在他莫昔芬誘導(dǎo)WNT16高表達(dá)的小鼠中，骨膜形成增加，骨皮質(zhì)明顯增厚，但骨小梁的數(shù)量并不增加[16]。這表明，他莫昔芬調(diào)節(jié)的WNT16可能主要發(fā)生在皮質(zhì)骨。在此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在小鼠的股骨皮質(zhì)骨中WNT16mRNA表達(dá)水平明顯升高。這一發(fā)現(xiàn)，更加證實(shí)了WNT16調(diào)控骨量的場所在骨皮質(zhì)。在這一項(xiàng)研究[16]中也解釋了這一現(xiàn)象，研究者整體上刪除了WNT16基因，小鼠的皮質(zhì)非常薄，而長骨和椎骨中的小梁卻正常。WNT16在旁作用于皮質(zhì)骨中的破骨細(xì)胞祖細(xì)胞，并對破骨細(xì)胞的形成產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致皮質(zhì)骨而不是小梁骨增加。因此，我們可以推測，WNT16作用于骨皮質(zhì)，在預(yù)防骨皮質(zhì)丟失中有積極作用，可能成為預(yù)防骨質(zhì)疏松非椎體骨折的靶點(diǎn)及藥物開發(fā)提供研究方向。

3 WNT16對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(GIOP)小鼠骨皮質(zhì)影響

糖皮質(zhì)激素(GC)由于其良好的抗炎、免疫抑制作用，廣泛地應(yīng)用于臨床，與此同時，由糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松及骨折風(fēng)險也大大增加[17]。GC降低皮質(zhì)骨含量和厚度，是骨質(zhì)疏松非椎體骨折的危險因素之一。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，GC通過減少各種信號成分，如 β-catenin蛋白來抑制經(jīng)典WNT信號通路。另外，GC還能促進(jìn)WNT抑制劑的產(chǎn)生從而抑制WNT信號[18]。這表明，GC誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松與WNT信號通路密切相關(guān)。WNT16作為WNT家族中的一員，與皮質(zhì)骨骨量與非椎體骨折密切相關(guān)[19]。因此，我們推測GC同樣能抑制WNT16而導(dǎo)致骨皮質(zhì)骨減少和骨折風(fēng)險增加。Hildebrandt 等[20]在使用潑尼松龍對成骨細(xì)胞作用中發(fā)現(xiàn)，潑尼松龍明顯抑制了WNT16在成骨細(xì)胞中的表達(dá)。為測試WNT16能否逆轉(zhuǎn)成骨細(xì)胞功能，在接下來的實(shí)驗(yàn)中，他們往潑尼松龍成骨細(xì)胞組中加入了重組WNT16，最后測試成骨細(xì)胞骨形成功能得以恢復(fù)。這一發(fā)現(xiàn)表明WNT16可能是逆轉(zhuǎn)GIOP的關(guān)鍵靶標(biāo)。但不足的是，本研究僅在細(xì)胞層面上表明WNT16能解除GC抑制成骨細(xì)胞功能，而在缺乏WNT16在表型上對GIOP的影響。在 Ohlsson等[21]一項(xiàng)研究中彌補(bǔ)了這一不足，他們比較了GC對野生型大鼠和WNT16過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠的骨密度發(fā)現(xiàn)，WNT16過表達(dá)的大鼠BMD顯著高于野生小鼠。這表明WNT16在表型上能拮抗GC導(dǎo)致的骨量流失而預(yù)防骨折風(fēng)險。值得疑惑的是，此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)GC降低了野生型WNT16mRNA的表達(dá)，但對WNT16過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠WNT16mRNA水平卻沒有影響。在另一項(xiàng)研究中得出了一個與此完全相反的結(jié)論，即WNT16的過表達(dá)并不能保護(hù)GC導(dǎo)致的骨量流失及增加的骨折風(fēng)險。Alam等[22]研究發(fā)現(xiàn)，GC都顯著降低了野生型和WNT16過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的骨密度，骨形成標(biāo)志物以及WNT16mRNA水平，雖然WNT16過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠骨密度，PIN1水平高于野生型，但這種差異可能是由基線水平、組間差異造成的，而且這種差異也不足以完全抵消GC造成的骨量流失和骨折風(fēng)險。但可以明確的是，WNT16對GC小鼠的骨形成、骨量增加有積極作用，但是否能完全抵抗GC誘導(dǎo)的骨量丟失尚有爭議，值得進(jìn)一步研究。

4 WNT16對去卵巢大鼠骨皮質(zhì)影響

絕經(jīng)后老年女性是骨質(zhì)疏松癥高發(fā)人群，對于她們來說，骨折是毀滅性的打擊[23]。在Mitek等[24]研究了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的基因易感性中發(fā)現(xiàn)，在這類人群中，WNT16 rs2908004基因變異的的多態(tài)性存在顯著差異。其中，骨折風(fēng)險大的人群中這一差異更為顯著。因此，我們推測WNT16與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松人群的骨折相關(guān)。在先前的研究[25]中，已證實(shí)雌激素能增加絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的骨密度和降低其骨折風(fēng)險。雌激素主要通過抑制破骨細(xì)胞分化來增加骨小梁和抑制皮質(zhì)內(nèi)骨吸收[25]。但其具體分子機(jī)制還不清楚。Almeida等[26]與Sims等[27]兩項(xiàng)對雌激素與WNT16相關(guān)性研究中，他們分別使用雌二醇和他莫西芬作用于成骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種雌激素類似物干預(yù)后WNT16的表達(dá)都有所上升。結(jié)果似乎表明了雌激素對預(yù)防骨折的風(fēng)險是通過WNT16介導(dǎo)的。在他莫西芬處理WNT16高表達(dá)，雌激素受體缺失的小鼠中，骨皮質(zhì)是雌激素受體缺失野生小鼠的十幾倍，這表明WNT16能彌補(bǔ)雌激素受體缺失導(dǎo)致的骨量流失。這似乎更加支持了雌激素對WNT16的直接調(diào)節(jié)。但在Movérare-Skrtic等[28]的研究中卻表明雌激素和WNT16的保骨作用是獨(dú)立的。WNT16高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠在摘除卵巢后，骨密度降低至與卵巢摘除的野生型小鼠一致。而且，在雌激素干預(yù)WNT16缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)中，仍然能提高小鼠骨強(qiáng)度。盡管雌激素保骨作用是否與WNT16相關(guān)還具有爭議，但是WNT16在卵巢摘除小鼠中，增加骨皮質(zhì)、預(yù)防骨折風(fēng)險卻是明確的[29]。綜上所述，WNT16可能成為預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨折的潛在靶標(biāo)。

5 年齡和性別對WNT16的影響

眾所周知，年齡和性別是骨質(zhì)疏松和骨折其中重要的影響因素[30]。在上文中論述了WNT16在GIOP和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的骨穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，但是缺乏了年齡和性別對WNT16的影響。Shen等[31]在性別和年齡對人骨髓基質(zhì)細(xì)胞WNT基因表達(dá)的研究中，僅發(fā)現(xiàn)WNT16在性別中存在明顯差異，且男性表達(dá)高于女性。而WNT16在不同年齡的大鼠中表達(dá)水平卻沒有發(fā)現(xiàn)差異。而在Todd 等[29]研究中發(fā)現(xiàn)，不管是雌性或雄性鼠，WNT16在骨皮質(zhì)中的表達(dá)隨年齡升高而降低，而在腎臟中表達(dá)卻沒有隨年齡而變化。因此，我們推測上述兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能源于檢測組織的不同。我們知道，WNT16主要表達(dá)在皮質(zhì)骨和骨膜，所以我們傾向于后者得出的結(jié)論，即WNT16的表達(dá)隨年齡增長而降低。這揭示了為什么老年人骨質(zhì)疏松患病率高和骨折風(fēng)險大的又一內(nèi)在原因。WNT16可能為老年性骨質(zhì)疏松提供研究方向。

6 總結(jié)與展望

WNT16在調(diào)控骨皮質(zhì)厚度與骨小梁密度起著至關(guān)重要的作用，由于它主要表達(dá)在皮質(zhì)骨和骨膜，因此，WNT16在預(yù)防非椎體骨折的作用可能更加重要。在上述的論述中，WNT16對老年、絕經(jīng)后、糖皮質(zhì)激素所造成的骨質(zhì)疏松和非椎體骨折均有一定作用。因此，WNT16可能成為預(yù)防各種類型骨質(zhì)疏松，以及骨質(zhì)疏松非椎體骨折的關(guān)鍵靶標(biāo)，從而為骨質(zhì)疏松非椎體骨折臨床研究，藥物設(shè)計提供一個有價值的新方向。近期，關(guān)于一種WNT脂肪酶——notum的研究中發(fā)現(xiàn)，這種脂肪酶能夠明顯抑制WNT信號通路，從而使骨皮質(zhì)顯著丟失[32]。在通過對notum抑制的研究中發(fā)現(xiàn)，notum抑制能明顯增加骨皮質(zhì)厚度[33]。因此，notum可能成為預(yù)防骨質(zhì)疏松非椎體骨折的又一潛在標(biāo)靶。只是，現(xiàn)階段關(guān)于notum的基礎(chǔ)研究尚少，notum與降低骨質(zhì)疏松風(fēng)險的關(guān)聯(lián)存疑，值得進(jìn)一步深入研究。