于洪杰 陳德強(qiáng)

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱骨科，山東 濟(jì)南 250014

骨質(zhì)疏松(osteoporosis, OP)作為一種臨床常見的代謝性骨病，以骨密度降低，骨微觀結(jié)構(gòu)退化為典型表現(xiàn)，骨骼脆性增加導(dǎo)致其骨折風(fēng)險增大[1]。近幾十年來，社會進(jìn)步導(dǎo)致生活方式的改變，肥胖已經(jīng)成為全球流行病，并有年輕化趨勢[2]，嚴(yán)重影響健康及生活質(zhì)量。骨質(zhì)疏松與肥胖作為兩種臨床常見內(nèi)分泌疾病，有著密切關(guān)系。一項納入907例觀察對象的對比研究發(fā)現(xiàn)，骨折組較非骨折組具有更高的體脂與腰圍, 且骨密度相對較低[3]。

肥胖可同時調(diào)控成骨和破骨細(xì)胞分化及增殖相關(guān)通路。而骨橋蛋白、骨鈣素等骨源性因素亦對體重和葡萄糖穩(wěn)態(tài)有內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用[4]。此外，骨髓間質(zhì)細(xì)胞可同時分化為脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞，當(dāng)肥胖患者脂肪細(xì)胞分化增加，造成脂肪堆積，抑制成骨細(xì)胞分化，則導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生；相反骨質(zhì)疏松的患者，骨量減少的同時骨髓脂肪組織會增加，引起肥胖[5]。當(dāng)然這兩者之間的聯(lián)系是基于基因背景下的，骨密度與BMI的遺傳相關(guān)性約為0.4，兩者之間存在共同多效性基因[6]。應(yīng)用生物信息學(xué)整合肥胖及骨質(zhì)疏松的基因數(shù)據(jù)，不僅能較為科學(xué)地從分子層面闡述肥胖與骨質(zhì)疏松間的影響機(jī)制，而且也為藥物同時干預(yù)兩種疾病提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

分別以骨質(zhì)疏松及肥胖為關(guān)鍵詞在相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫(Disgenet、TTD、OMIM、Drugbank、KEGG)中篩選相關(guān)靶點，將兩組基因通過uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成uniprot ID進(jìn)行去重整合，獲得已明確的疾病靶點。然后將兩組靶點映射取得韋恩圖，將得到的關(guān)鍵靶點通過string數(shù)據(jù)庫制作靶點間相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)TSV格式導(dǎo)進(jìn)Cytoscape3.7.2，篩選節(jié)點連接度(degree)≥13的靶點制作核心靶點圖。通過基因功能注釋DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO(gene ontology)生物過程富集分析以及 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析使基因信息可視化，分別將篩選出的前10個GO條目與KEGG條目，依據(jù)Omicshare云平臺制作高級氣泡圖。

2 結(jié)果

經(jīng)過基因庫搜索、轉(zhuǎn)換ID查重整合后共選出與骨質(zhì)疏松癥和肥胖相關(guān)基因 336 個和398個。映射出關(guān)鍵靶點56個，生成韋恩圖(見圖1)。經(jīng)string數(shù)據(jù)庫在0.7高信度下生成相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖2)， 256個靶點之間有216條相互作用關(guān)系。以篩選節(jié)點連接度(degree)≥13篩選到核心靶點15個(如圖3)，所獲核心靶點均直接或間接影響肥胖與骨質(zhì)疏松。經(jīng)DAVID 數(shù)據(jù)庫獲得31項GO富集結(jié)果(P<0.05)及55條KEGG信號通路(P<0.05)，以P值升序排列，分別篩選出符合條件的10個生物過程和信號通路，并將其以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來(見圖4、圖5)。生物過程及通路下所含靶點分別見表1、表2。

圖1 肥胖與OP映射關(guān)鍵靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of obesity and OP mapping key targets

圖2 關(guān)鍵靶點互相作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖(0.7高信度)Fig.2 PPI network diagram of key target interaction (0.7 high reliability)

圖3 核心靶點圖(核心靶點大小為degree大小)Fig.3 Core target map (core target size is degree size)

圖4 GO富集分析氣泡圖(前10條)Fig.4 Bubble diagram of GO enrichment analysis (first 10)

圖5 KEGG通路分析氣泡圖(前10條)Fig.5 Bubble diagram of Kegg pathway analysis (first 10)

3 討論

近年來隨著研究的深入，諸多數(shù)據(jù)表明肥胖與骨質(zhì)疏松有關(guān)，且脂肪組織的含量與骨密度呈負(fù)相關(guān)[7]。肥胖與骨質(zhì)疏松作為兩種常見的臨床代謝性疾病，發(fā)病機(jī)制相對復(fù)雜，在各自龐大的基因網(wǎng)絡(luò)中，也有部分重合的基因信息。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)尋找龐大基因交叉部分，通過核心靶點GO分析發(fā)現(xiàn)肥胖與骨質(zhì)疏松間相互影響主要涉及以下生物過程：對胰島素的反應(yīng)、炎癥應(yīng)答、受體生物合成過程、棕色脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)等。通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，肥胖與骨質(zhì)疏松之間可涉及多條共同信號通路，主要涉及炎癥因子、缺氧、脂肪細(xì)胞、糖代謝等方面。TNF-α是典型的高表達(dá)炎癥細(xì)胞因子，依據(jù)雙變量全基因組連鎖分析就發(fā)現(xiàn)了TNF-α存在于肥胖和骨質(zhì)疏松癥共有的基因組區(qū)域[8]。TNF-α對于肥胖的影響同時基于糖代謝與炎癥兩個方面。肥胖作為機(jī)體炎癥應(yīng)激源會刺激TNF-α的合成與分泌，而升高的TNF-α又會通過影響胰島素敏感度，調(diào)控糖脂代謝，從而增加肥胖的發(fā)生風(fēng)險[9]。TNF-α和骨代謝關(guān)系密切，通過刺激炎癥細(xì)胞因子及直接上調(diào)破骨細(xì)胞活性，加速骨吸收，促進(jìn)骨質(zhì)疏松進(jìn)展[10]。研究顯示缺氧對大鼠成骨細(xì)胞的骨形成能力起到抑制作用[11]，而HIF主要調(diào)節(jié)組織、細(xì)胞適應(yīng)低氧或缺氧環(huán)境。HIF除能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞外[12]，同時也能影響VEGF通路，通過誘導(dǎo)VEGF活化增加成骨細(xì)胞的微血管浸潤，增加供氧及供血量。肥胖患者由于脂肪組織過度肥大，與血管生成不平衡時，局部會因缺氧激活HIF-1α，調(diào)控VEGF通路促進(jìn)血管生成與構(gòu)建[13]。這三條通路貫穿于肥胖與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過程，脂肪細(xì)胞生長與血管新生不平衡時，會造成組織缺氧，缺氧狀態(tài)促進(jìn)炎癥介質(zhì)的分泌，加快骨質(zhì)疏松進(jìn)程，同時促進(jìn)微血管的新生重建，增加供養(yǎng)供血。脂肪細(xì)胞因子也可能通過多途徑影響骨重建[14]，比如瘦素(leptin)可刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成[15]；脂聯(lián)素(adiponectin)除促進(jìn)骨形成外，也通過抑制脂肪細(xì)胞的形成，負(fù)性調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞[16]；網(wǎng)膜素-1(omentin-1)預(yù)防骨質(zhì)疏松則是通過抑制促炎因子表達(dá)[17]。而Toll樣受體(TLRs)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與肥胖、骨質(zhì)疏松、糖尿病等代謝性疾病關(guān)系密切。肥胖小鼠脂肪組織內(nèi)TLR高表達(dá)，細(xì)胞因子(TNFα、IL-6等) 表達(dá)也隨之升高[18]。其中TLR4參與的炎癥反應(yīng), 可通過激活其他其他通路如Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP、Notch等成骨通路，參與骨代謝[19]。AMPK信號通路干預(yù)肥胖與骨質(zhì)疏松則是通過調(diào)節(jié)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的成骨成脂分化，PPARγ 能夠促進(jìn)成脂分化, 而Wnt/β-catenin通路則是促進(jìn)成骨分化[20]。諸多體外研究表明AMPK能磷酸化 β-catenin, 促進(jìn)成骨[21]；也可直接通過調(diào)節(jié)PPARγ 的活性促進(jìn)成脂，抑制成骨[22]。FOXO同樣屬于促炎因子相關(guān)通路一種，參與包括肥胖及骨質(zhì)疏松的炎癥調(diào)節(jié)。此外，包橋橋等[23]研究發(fā)現(xiàn)FOXO1磷酸化能夠改善細(xì)胞胰島素抵抗，調(diào)節(jié)糖代謝，維持細(xì)胞葡萄糖狀態(tài)。胰島素抵抗通路及2型糖尿病信號通路也均是調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)通路，糖代謝障礙引起脂肪積累，是肥胖發(fā)生的重要危險因素[24]。有研究[25]發(fā)現(xiàn)，葡萄糖水平升高會使誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的作用更加明顯。高糖環(huán)境不僅影響成骨，同時調(diào)控破骨細(xì)胞，Williams等[26]發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞在7～25 mmol/L水平時能夠使骨吸收最活躍。強(qiáng)勝林等[27]通過對補(bǔ)腎固本方研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT/m TOR信號通路激活，可以保護(hù)小梁結(jié)構(gòu)，下調(diào)破骨細(xì)胞分化，減少去卵巢后大鼠OP發(fā)生率。白穎等[28]則是通過蛋白印跡檢測法發(fā)現(xiàn)降糖3號方可能通過激活PI3K/AKT信號通路改善糖脂代謝，控制肥胖小鼠體重。胡玲美等[29]研究發(fā)現(xiàn)黃芪、葛根配伍起到降糖降脂的作用同樣通過增加PI3K/AKT mRNA的表達(dá)。綜上所述，不難看出肥胖與骨質(zhì)疏松之間有著密切聯(lián)系，諸多通路主要是直接或間接通過炎癥介質(zhì)及糖脂代謝調(diào)控二者進(jìn)程，同時我們也發(fā)現(xiàn)很少有學(xué)者研究通路對肥胖及骨質(zhì)疏松產(chǎn)生共同影響。

表1 GO富集分析所含靶基因(前10條)

本研究依據(jù)生物信息學(xué)找到肥胖與骨質(zhì)疏松相關(guān)聯(lián)靶點，并通過基因可視化，使網(wǎng)絡(luò)樣作用關(guān)系愈加清晰。當(dāng)然此類基因靶點的信息整合依賴于生物信息與計算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性決定著整合信息的可靠性，同時對于基因表達(dá)量及靶點激活程度等也需隨生信技術(shù)發(fā)展進(jìn)一步研究。