岳志軍 姜自偉 李紫閣 李紹爍 阮冠龍 王睿 趙京濤*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214071

骨質(zhì)疏松癥是臨床上的常見病，其特點(diǎn)以骨量降低、骨組織結(jié)構(gòu)異常、導(dǎo)致骨脆性增加、繼發(fā)骨折的危險性增加為特征的骨骼疾病[1]。由于人口老齡化, 骨質(zhì)疏松癥以及其導(dǎo)致的骨折發(fā)病率居高不下。西醫(yī)治療OP的藥物常包括骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑、骨礦化藥物以及新近報道的藥物等[2]。但是西藥治療OP仍然有很多缺陷，常會出現(xiàn)服藥后不良反應(yīng)，不少抗OP藥會導(dǎo)致患者不耐受，此外還有一些藥物對于治療OP的療效不確切[3]。近年來，隨著中醫(yī)藥自身的不斷發(fā)展，保持自身內(nèi)涵的同時結(jié)合現(xiàn)代科技，中醫(yī)對骨質(zhì)疏松癥的研究日益增多，中醫(yī)藥理論治療OP有效性的研究不斷被挖掘，凸顯中醫(yī)治療OP的優(yōu)勢，并取得了一定的成果[4]。

中醫(yī)理論中無骨質(zhì)疏松的病名，按照其癥狀及相關(guān)臨床特點(diǎn)可以將其歸納于“骨痿”、“虛勞”、“骨痹”等范疇[5]。肝腎虧虛，筋脈不利是骨痿的基本病機(jī)[6]。肝腎不足會導(dǎo)致氣滯血瘀，并且氣滯血瘀也會導(dǎo)致肝腎虧虛，因此老年骨質(zhì)疏松癥患者通常具有肝腎不足兼氣滯血瘀的特征?！把a(bǔ)腎強(qiáng)筋，活血化瘀”是中醫(yī)藥治療骨痿病癥的重要原則，目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)及臨床研究已經(jīng)證實(shí)[7-9]，補(bǔ)腎活血湯在促進(jìn)骨折愈合、提高骨密度及改善骨代謝水平等方面療效顯著，但其內(nèi)在成分眾多，分子間作用關(guān)系十分復(fù)雜，致使其微觀作用機(jī)制缺乏全面、系統(tǒng)的闡述，需要進(jìn)一步探討。

本研究將《傷科大全》里面的經(jīng)典名方補(bǔ)腎活血湯[10-12]進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，挖掘補(bǔ)腎活血湯抗骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，探索關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接，揭示補(bǔ)腎活血湯“從虛從瘀”治療OP的內(nèi)在分子機(jī)理，為臨床抗骨質(zhì)疏松發(fā)揮中醫(yī)藥特色提供科學(xué)指導(dǎo)方案。

1 材料和方法

1.1 補(bǔ)腎活血湯化合物及靶點(diǎn)預(yù)測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分別對補(bǔ)腎活血湯中的中藥“熟地”、“菟絲子”、“杜仲”、“枸杞”、“山萸肉”、“肉蓯蓉”以及“當(dāng)歸”、“紅花”、沒藥、“獨(dú)活”進(jìn)行檢索，按ADME原則(口服利用度≥30 %，類藥性≥0.18)[13-14]進(jìn)行篩選，獲得其化合物，并預(yù)測其對應(yīng)靶點(diǎn)；根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因注釋，規(guī)范對應(yīng)靶點(diǎn)信息。對未檢索到的中藥“補(bǔ)骨脂”，分別從BATM-TCM數(shù)據(jù)庫、化學(xué)數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫以及知網(wǎng)中查詢相關(guān)化合物，然后通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取化合物的2D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss ADME得到其SMILES，同樣根據(jù)ADME原則進(jìn)行篩選，對篩選出的化合物通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測，獲取其對應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2 骨質(zhì)疏松癥的疾病靶點(diǎn)收集

以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞，分別從Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫搜索相關(guān)的作用靶點(diǎn)，對收集到的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合、去重，預(yù)測出疾病相關(guān)靶點(diǎn)，獲取相應(yīng)的基因標(biāo)準(zhǔn)名。利用韋恩圖在線制作網(wǎng)站Draw Venn Diagram，獲取藥物與靶點(diǎn)交集基因數(shù)目，繪制出韋恩圖。

1.3 構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)

將中藥、活性成分、靶點(diǎn)、疾病相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，使用“Network Analyzer”功能獲得其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，然后根據(jù)“Degree”值篩選出核心化合物。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建

將1.3中獲得的交集基因?qū)氲鞍谆プ髌脚_String數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)出其蛋白間相互作用數(shù)據(jù)至Cytoscape 3.7.2進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。

1.5 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析

使用 R 軟件及其后臺數(shù)據(jù)庫“org.Hs.eg.db”獲取潛在作用靶點(diǎn)的基因 ID；再利用“DOSE”、“cluster Profiler”、“path view”程序包對這些潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行 GO和KEGG富集分析；GO 功能富集分析包括三個方面的內(nèi)容：生物學(xué)過程富集分析(biological process, BP)、細(xì)胞組成富集分析(cellular component, CC)、分子功能富集分析(molecular function, MF)，設(shè)定 p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05；將每一類按照顯著性進(jìn)行排序，把排在GO 功能富集分析前10和KEGG富集分析前30的富集條目通過柱狀圖和氣泡圖的形式進(jìn)行可視化展示。

1.6 分子對接

為進(jìn)一步明確補(bǔ)腎活血湯“從虛從瘀”治療OP的內(nèi)在分子機(jī)制，將1.3和1.4中篩選出的核心化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。通過pubchem網(wǎng)站檢索獲取核心化合物的3D結(jié)構(gòu)，下載SDF文件并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從 Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫中檢索獲得受體，利用PYMOL 2.3.4軟件對受體進(jìn)行去水、去配體等操作，采用Autodock 4.2.6軟件對受體進(jìn)行加氫以及計算電荷處理，設(shè)置受體對接格點(diǎn)參數(shù)將小分子配體可能結(jié)合的活性口袋位點(diǎn)進(jìn)行包含，并將受體和配體分別轉(zhuǎn)化為pdbqt格式，利用Auto Dock Vina 1.1.2對受體與配體分別進(jìn)行分子對接，對接后獲取其構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎活血湯活性成分篩選和對應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共篩選出162種化合物，并預(yù)測出2 568個活性靶點(diǎn)，經(jīng)整理去重獲得146個對應(yīng)靶點(diǎn)；補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分共148個，得到9種活性化合物，預(yù)測出56個活性靶點(diǎn)，整理去重獲得29個對應(yīng)靶點(diǎn)。最終補(bǔ)腎活血湯共獲得171種化合物，其中當(dāng)歸2個、熟地2個、獨(dú)活9個、杜仲24個、枸杞40個、紅花17個、沒藥43個、肉蓯蓉6個、山茱萸17個、菟絲子10個、補(bǔ)骨脂9個，中藥之間共有成分有11個，分別為beta-sitosterol、quercetin、stigmasterol、kaempferol、CLR、yangambin、beta-carotene、Mandenol、Ethyl linolenate、poriferast-5-en-3beta-ol、sitosterol。將補(bǔ)骨脂與其余10種中藥的對應(yīng)的靶點(diǎn)合并去除重復(fù)，共收集到166種活性靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)的搜集

通過Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到與“osteoporosis”相關(guān)靶標(biāo)1 335個。將補(bǔ)腎活血湯與OP中的靶標(biāo)取交集共獲得54個交集基因，見圖1。分別為PON1、JUN、NOS2、ESR1、AR、PPARG、PTGS2、CA2、PGR、SLC6A4、ESR2、NR3C1、DPP4、RXRA、NR3C2、TNFSF15、MMP1、SELE、VCAM1、CYP3A4、HMOX1、GSTM1、DRD2、ODC1、MMP2、IL6、MAPK1、CTSD、CCL2、IL1B、MPO、F3、SOD1、TP63、COL1A1、EGF、VEGFA、POR、COL3A1、RB1、IL-2、MMP3、CASP7、MMP13、MMP8、APP、CYCS、G6PD、EHHADH、CYP19A1、AKT1、HTR2A、HTR2C、ESRRA。

圖1 補(bǔ)腎活血湯與OP的交集基因Fig.1 The intersection gene of Bushen Huoxue decoction and osteoporosis

2.3 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)分析

通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點(diǎn)及邊的數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯鐖D2，其中紅色代表疾病，藍(lán)色代表中藥，綠色代表靶點(diǎn)，紫色代表有效成分。共得到207個節(jié)點(diǎn)，其中包括疾病節(jié)點(diǎn)1個、中藥節(jié)點(diǎn)11個、活性化合物節(jié)點(diǎn)141個、疾病與藥物共有靶點(diǎn)54個和975條邊。其中“Degree”和“Closeness”是對網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)重要性的描述，兩者值越大，表示該節(jié)點(diǎn)越重要。以“Degree”值的中位數(shù)進(jìn)行篩選，篩選出大于平均數(shù)的化合物作為核心化合物。共篩選出11個核心成分，其中前5個分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇。表示以上成分可能為治療OP的重要成分。

圖2 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “Chinese medicine-component-target-disease” visualization network

2.4 補(bǔ)腎活血湯治療骨質(zhì)疏松癥的作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用String數(shù)據(jù)庫對藥物與疾病共同作用的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進(jìn)行PPI可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并對蛋白互作靶點(diǎn)前30的關(guān)鍵靶點(diǎn)展示，如圖3～圖4。其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，邊表示蛋白質(zhì)之間的結(jié)合的關(guān)系?！癉egree”值越大，表示該蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大，圖形越大，顏色越深；邊越粗，顏色也越深，表示蛋白與蛋白相互作用關(guān)系越緊密。利用“Degree”值中位數(shù)逐步進(jìn)行篩選，獲取其核心靶點(diǎn)，共篩選到13個核心靶點(diǎn)蛋白，分別為AKT1、IL6、VEGFA、JUN、EGF、PTGS2、CCL2、MAPK1、IL1B、CYCS、MMP2、ESR1、PPARG。表明補(bǔ)腎活血湯通過多靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)、血管形成等達(dá)到抗OP的作用。

圖3 補(bǔ)腎活血湯治療OP的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The protein interaction network of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of OP

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中前30關(guān)鍵靶點(diǎn)柱狀圖Fig.4 Histogram of the top 30 key targets in the PPI network

2.5 GO和KEGG富集分析

利用R語言統(tǒng)計軟件對富集結(jié)果使用柱狀圖和氣泡圖進(jìn)行展示。GO功能富集分析共得到279個富集結(jié)果，其中BP、CC、MF分別有198、35、46個富集結(jié)果。對排名前10 的條目進(jìn)行柱狀圖展示，如圖5。其中BP中涉及最高的是營養(yǎng)水平、類固醇激素、腺體發(fā)育等，CC主要聚集于膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等區(qū)域，MF主要集中在類固醇激素受體活性、內(nèi)肽酶活性、核受體活性等，預(yù)測補(bǔ)腎活血湯主要通過以上生物學(xué)過程中發(fā)揮抗OP的作用。KEGG通路富集分析共有63個富集結(jié)果，并對其中前30條信號通路進(jìn)行富集展示，其中 AGE-RAGR、TNF、IL17、HIF-1等信號通路可能與抗OP相關(guān)，表明補(bǔ)腎活血湯在抗炎、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和修復(fù)及再生損傷組織等方面發(fā)揮重要作用。如圖6。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接

為進(jìn)一步明確補(bǔ)腎活血湯治療OP的關(guān)鍵靶標(biāo)與活性成分之間的結(jié)合效能，本研究選取排名前5的活性化合物與核心靶標(biāo)進(jìn)行分子對接，分子對接結(jié)合能打分及對接參數(shù)如表1所示，結(jié)合能越低，說明分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合越穩(wěn)定，分別取stigmasterol和MAPK1、stigmasterol和PPARG、beta-sitosterol和PPARG對接構(gòu)象進(jìn)行作圖分析，如圖7。表明補(bǔ)腎活血湯中的β-谷甾醇、豆甾醇主要與MAPK1和PPARG具有良好的結(jié)合力，能夠充分發(fā)揮抗OP的作用。

表1 關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接結(jié)合能打分及對接參數(shù)Table 1 Docking and binding energy scores and docking parameters of key compounds and key target molecules

圖7 補(bǔ)腎活血湯核心化合物治療OP的3個核心靶點(diǎn)的對接結(jié)果Fig.7 Docking results of the three core targets of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of OP

3 討論

補(bǔ)腎活血湯具有補(bǔ)腎壯筋，活血止痛之功效，主治肝腎虧損，筋骨失養(yǎng)之骨痿。方中熟地、杜仲、菟絲子、補(bǔ)骨脂、枸杞子、山茱萸、肉蓯蓉補(bǔ)益肝腎，填補(bǔ)精血，強(qiáng)壯筋骨；配以歸尾、紅花、獨(dú)活、沒藥活血化瘀止痛，疏通筋脈，全方滋補(bǔ)腎精之中兼有化瘀之力。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，探討補(bǔ)腎活血湯治療OP的分子機(jī)制。根據(jù)“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)顯示的11個核心成分，大多具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用。β-谷甾醇和豆甾醇在抗氧化、抗高血脂、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面表現(xiàn)出良好的藥理作用[15-16]。槲皮素和山奈酚具有多種生物學(xué)活性，它具有抗氧化及清除自由基的作用，還具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖等作用[17-18]。

通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，共顯示13種治療OP的核心靶點(diǎn)，其中VEGFA對于OP的發(fā)生起著重要作用，其作用于內(nèi)皮細(xì)胞，能夠增加毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)局部血管的生成[19]。此外，VEGFA還能通過調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮抗OP的作用。研究表明，VEGFA能夠促進(jìn)BMSCs的增殖和分化，同時還增加骨鈣蛋白(BGP)和新生血管的數(shù)量[20]，預(yù)測VEGFA在骨骼血管化過程中與抗OP有關(guān)。而且在OP老鼠模型當(dāng)中，補(bǔ)腎活血中藥能夠顯著提高mRNA表達(dá)量，還能夠顯著提高VEGF蛋白表達(dá)水平，對腎虛血瘀骨代謝失常而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松能夠發(fā)揮抗OP的作用[21]。這可能與補(bǔ)腎活血湯“從虛”治療骨質(zhì)疏松關(guān)系密切，客觀上達(dá)到“補(bǔ)腎壯骨”的目的。IL-6可以作用于成骨細(xì)胞，促使其分泌作用于機(jī)體，參與機(jī)體病理性骨量丟失的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，骨質(zhì)疏松的情況越突出，IL-6的水平也相應(yīng)的增加[22]，表明IL-6與骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。動物性研究也表明，去卵巢大鼠表現(xiàn)為IL-6水平與大鼠腰椎、關(guān)節(jié)骨密度均呈明顯負(fù)相關(guān)[23]。由此推論，補(bǔ)腎活血湯中活性成分通過調(diào)控IL-6發(fā)揮抗炎作用來改善骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過程。

GO和KEGG結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血湯通過多種生物學(xué)過程以及多信號通路參與治療OP的過程。晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)，是一種多配體受體，能夠與多種配體相結(jié)合RAGE存在于許多類型細(xì)胞中，其參與了炎癥消退、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持和損傷后的修復(fù)及再生等過程[24]。在骨質(zhì)疏松過程中，RAGE的數(shù)量會明顯上調(diào)，此外其還參與調(diào)節(jié)骨代謝過程[25]。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs與sRAGE水平的升高與老年男性髖部骨折發(fā)生率的增加有關(guān)，并與骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松的發(fā)生顯著相關(guān)[26]。在成骨細(xì)胞中，AGE和RAGE的組合可激活Raf/MEK/ERK信號傳導(dǎo)途徑，降低成骨細(xì)胞活性并導(dǎo)致veslin-1和LC3B介導(dǎo)的自噬激活[27]。可以推測出補(bǔ)腎活血湯“從瘀”治療骨質(zhì)疏松與調(diào)節(jié)AGE-RAGE通路的關(guān)系密切。

根據(jù)成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心成分與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，stigmasterol和MAPK1、PPARG，beta-sitosterol和PPARG之間結(jié)合能分?jǐn)?shù)最低，容易結(jié)合成穩(wěn)定的構(gòu)象。這表明這些成分與OP的治療具有重要作用，可將這些成分用于探索治療OP作為研究方向。本研究主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接來闡述補(bǔ)腎活血湯抗OP的內(nèi)在機(jī)制，未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究，需要進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)角度探索本研究結(jié)果。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，闡述補(bǔ)腎活血湯“從虛從瘀”治療骨質(zhì)疏松的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和相互作用機(jī)制。補(bǔ)腎活血湯對骨質(zhì)疏松的治療體現(xiàn)了多靶點(diǎn)、多成分、多通路的作用特點(diǎn)，為闡述中醫(yī)藥理論提供了科學(xué)的解釋，為進(jìn)一步探討補(bǔ)腎活血湯治療OP奠定了基礎(chǔ)。