張麗媛 納青青 周麗敏 劉鈺瑜

1.廣東醫(yī)科大學(xué)解剖教研室，廣東 湛江 524023 2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，廣東 湛江 524023

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種與衰老有關(guān)的代謝性骨病，其特征是骨量的減少和骨微結(jié)構(gòu)的改變。它能導(dǎo)致髖部和脊柱骨折，嚴重地影響老年人的生活質(zhì)量[1-2]。1型糖尿病(T1DM)是一種胰島素絕對不足導(dǎo)致的高血糖代謝性疾病。T1DM伴有多種并發(fā)癥，其中包括骨代謝紊亂[3]。絕經(jīng)后的糖尿病婦女由于雌激素和胰島素不足導(dǎo)致的骨折風(fēng)險急劇升高[4]。盡管雌激素和胰島素在骨轉(zhuǎn)換中起重要作用，但臨床上使用激素替代療法有導(dǎo)致乳腺癌等其他疾病增加的風(fēng)險[5]。因此，加緊研究其他治療絕經(jīng)后糖尿病性骨質(zhì)流失的方法是必要的。

蝦青素(astaxanthin, ASX)是一種含有酮基的類胡蘿素，主要形成于真菌和微藻，并可富集于動物甲殼和毛發(fā)中的天然葉黃素類胡蘿卜素。它具有多種藥理作用，包括了抗炎、抗癌和抗氧化[6]。研究表明蝦青素對雌激素缺乏導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的大鼠有保護作用。對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠也有降糖作用[7]。但是否對雌激素不足合并糖尿病導(dǎo)致的骨質(zhì)流失有保護作用仍是未知。

切除大鼠雙側(cè)卵巢是雌激素不足引起骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典動物模型，鏈脲佐菌素主要作用是誘導(dǎo)建立T1DM。在本實驗中，我們建立一個鏈脲佐菌素誘導(dǎo)去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松模型來研究蝦青素對卵巢切除聯(lián)合糖尿病所致骨質(zhì)疏松的保護作用以及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

蝦青素購置山東青島宏宇公司，鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司；所有其他化學(xué)藥品和試劑都是標準的商用生物用途。

1.2 動物和分組治療

健康雌性SD大鼠，體重(200±20)g。實驗經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理委員會批準。

隨機分為3組，每組6只大鼠，分別為CON：對照組(n=6)；OVX/T1DM：去卵巢合并糖尿病組(n=6)；OVX/T1DM-ASX用蝦青素[100 mg/ (kg.d)]治療去卵巢糖尿病大鼠(n=6)。OVX/T1DM、OVX/T1DM-ASX組切除雙側(cè)卵巢，對照組大鼠切除卵巢周圍一塊脂肪。術(shù)后15 d，OVX/T1DM、OVX/T1DM-ASX接種鏈脲佐菌素65 mg/kg，對照組注射同體積檸檬酸鹽緩沖液。72 h后，采集尾靜脈的血樣測血糖，血糖濃度大于16.7 mmol/L的大鼠被認為造模成功。OVX/T1DM-ASX組大鼠造模成功后開始灌胃蝦青素(100 mg/kg)60 d，其他兩組大鼠給予等體積生理鹽水。

1.3 檢測血清中鈣、磷、OPG、RANKL和骨代謝標志物

實驗結(jié)束后，稱重大鼠，采用心臟穿刺法采集血液。2 000 r/min離心15 min。血清中的鈣磷用原子吸收光譜儀(AAS-900T，Perkin Elmer，Waltham, MA, USA)分析。使用酶聯(lián)免疫吸附法測定ALP、CTX-1、骨鈣素、PINP、TRACP5b、OPG和RANKL的水平。試劑盒購自北京北方生物科技有限公司。

1.4 檢測骨密度(BMD)

采用雙能X射線吸收測定法(DXA)進行測量。

1.5 骨組織病理學(xué)及組織形態(tài)學(xué)分析

取大鼠右股骨，先用pH 7.4的多聚甲醛固定24 h，再用10 % EDTA溶液脫鈣28 d。用蘇木精和伊紅染色后被縱向切割成5 μm進行檢查。

1.6 骨髓脂肪細胞分析

顯微鏡下觀察股骨的蘇木精、伊紅染色切片，用計算機程序(Image-Pro Plus Version 5.0)對每一組切片都進行測量，計算股骨骨髓脂肪細胞數(shù)(數(shù)量/mm2)及平均脂肪細胞直徑(μm)。

1.7 免疫組化檢測OPG和RANKL

將厚度為5 μm的股骨載玻片浸泡在檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中，用3 % BSA阻滯，放于14 kW 微波15 min用于抗原提取。OPG和RANKL的主要抗體(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)以1∶200進行稀釋，在37 ℃的潮濕室中孵育1 h。免疫染色陰性對照采用兔IgG代替原抗體。用辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育1.5 h, 然后用DAB底物溶液進行孵育，蘇木精復(fù)染。

1.8 骨組織中OPG和RANKL mRNA表達的RT-PCR分析

按Gibco公司Trizol Total Isolation Reagent說明書進行提取總RNA，在擴增儀上進行RT-PCR。引物如下：OPG(635 bp)：5’-TGA GTG TGA GGA AGG GCG TTAC-3’； 相反：5’-TTC CTC GTT CTC TCA ATC TC-3’(60 ℃)。RANKL(750BP)；5’-ATC AGA AGA CAG CAC TCA CT-3’；相反：5’-ATC TAG GAC ATC CAT GCT AAT GTT C-3’(55 ℃)。β-actin(240 bp)5’-GGG CAC AGT GTG GGT GAC-3’，相反5’-CTG GCA CCA CAC CTT CTA C-3’(55 ℃)。反應(yīng)條件如下：95 ℃變性1 min，57 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，35次循環(huán)，最終70 ℃延伸1 min。所有實驗至少重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)進行組間比較，采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重

圖1所示，OVX/T1DM組大鼠體重在實驗期間呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，使用蝦青素藥物組大鼠的體重的下降趨勢能被抑制。經(jīng)過60 d的治療，OVX/T1DM-ASX的大鼠最終體重明顯高于OVX/T1DM組大鼠(P<0.05)。

圖1 蝦青素對各實驗組(A)體重的影響Fig.1 Effects of Astaxanthin(ASX) on body weight in each experimental group

2.2 腰椎、股骨骨密度的測定

圖2所示，與對照組大鼠相比，OVX/T1DM組大鼠的腰椎和股骨的BMD均明顯降低(P<0.01)，但是OVX/T1DM-ASX組未觀察到骨密度明顯下降。此外，OVX/T1DM-ASX組大鼠的腰椎和股骨BMD與對照組相比差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，提示蝦青素的治療對BMD有保護作用。

圖2 蝦青素對各實驗組骨密度(BMD)的影響Fig.2 Effects of Astaxanthin on bone mineral density(BMD) in each experimental group

2.3 血清中血糖、鈣、磷、OPG、RANKL、骨代謝標志物

如表1所示，OVX/T1DM組大鼠的血糖相比對照組和OVX/T1DM-ASX組大鼠明顯升高。在OVX/T1DM組中，ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP 5b、PIPN和RANKL顯著升高 (P< 0.01)。血清Ca、P、OPG和OPG/RANKL比值OVX/T1DM組相對于OVX/T1DM- ASX 組明顯降低(P< 0.01)。

表1 各實驗組的血糖及骨代謝指標

2.4 股骨的組織形態(tài)學(xué)分析

如圖3 所示，與對照組相比，觀察到OVX/T1DM組股骨小梁斷裂，骨小梁間距增大。OVX/T1DM組皮質(zhì)厚度也較對照組下降。在OVX/T1DM- ASX組中股骨的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)無明顯變化。

圖3 各實驗大鼠骨形態(tài)學(xué)觀察Fig.3 Observation of bone morphology in each experimental rats

骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)如骨體積百分比(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離(Tb.Sp)、皮質(zhì)厚度(CT)在OVX/T1DM大鼠應(yīng)用蝦青素治療60 d后，對比模型組無明顯變化。

2.5 股骨骨髓脂肪細胞密度和骨髓脂肪細胞直徑

組織學(xué)切片顯示，OVX/T1DM組股骨骨髓脂肪細胞數(shù)量和脂肪細胞直徑較對照組增加， OVX/T1DM-ASX組股骨骨髓脂肪細胞數(shù)量和脂肪細胞直徑恢復(fù)。與對照組相比，OVX/T1DM組骨髓脂肪細胞密度和平均脂肪細胞直徑顯著增加(P<0.01)，且所有這些參數(shù)在蝦青素治療60 d的OVX/T1DM大鼠中均有所改善。

2.6 骨組織中OPG和RANKL mRNA表達及骨組織中OPG/RANKL mRNA比值

圖6所示，在OVX/T1DM 中，OPG mRNA降低，RANKL mRNA上調(diào)，OPG/RANKL mRNA比值與對照組比較降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，蝦青素治療60 d(OVX/T1DM-ASX組)后OPG/RANKL比值恢復(fù)到對照組水平。

注：A 骨體積百分比；B 骨小梁厚度；C 骨小梁分離度；D 皮質(zhì)骨厚度。圖4 所有實驗組的骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)Fig.4 Bone histomorphometric parameters in all experimental groups

圖5 所有實驗組骨髓脂肪細胞參數(shù)Fig.5 Bone marrow adipocyte parameters in all experimental groups

圖6 所有實驗組骨組織中OPG和RANKL mRNA表達的情況Fig.6 The expression of OPG and RANKL mRNA in bone tissue, and OPG/RANKL mRNA ratio in bone tissues of all experimental groups

2.7 各組大鼠骨組織中OPG、RANKL蛋白表達情況

免疫組織化學(xué)染色顯示，與對照組相比, OVX/T1DM組OPG蛋白表達量降低，RANKL表達增加。蝦青素補充有效增加了OPG的表達，降低了RANKL的表達 (圖7、8)，如圖8所示OPG陽性染區(qū)與RANKL陽性染區(qū)百分比(%)，OVX/T1DM-ASX和對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖7 各實驗組OPG和RANKL 骨組織中OPG、RANKL蛋白表達情況Fig.7 The expression of OPG and RANKL protein in the femoral bone tissues of each group

圖8 各實驗組股骨組織OPG和RANKL陽性染色面積百分比Fig.8 Percentage(%)of the positive staining area of OPG and RANKL in the femoral bone tissues of each group

3 討論

雌激素缺乏和高血糖都能影響骨轉(zhuǎn)換[8-9]。在絕經(jīng)后糖尿病患者體內(nèi)，這兩種因素同時發(fā)生，會導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換速度加快，同時發(fā)生累加性的骨量丟失。羥酮結(jié)構(gòu)的蝦青素，是從深海藻體、海洋動物中提取的胡蘿卜素，具有很高的醫(yī)學(xué)價值。蝦青素及其提取物在歐美、日本、東南亞等發(fā)達國家已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，并且迄今為止未見報道其不良影響，包括對母體或胚胎的毒性和致畸效應(yīng)[10]，藥用價值具有非常廣闊的開發(fā)前景。研究結(jié)果表明，蝦青素能降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)血糖水平升高和改善雌激素不足引起的骨量丟失[11-12]。然而，還沒有證據(jù)表明蝦青素補充對合并雌激素和胰島素不足導(dǎo)致的骨質(zhì)流失是有益的。

在本研究中，我們建立了去卵巢糖尿病性骨質(zhì)疏松的大鼠模型。在切除卵巢的糖尿病大鼠中我們觀察到骨組織形態(tài)學(xué)的改變、骨密度下降、骨轉(zhuǎn)換加快，提示實驗動物造模的有效性。蝦青素治療60 d后，骨密度、血清骨轉(zhuǎn)換標記物、骨微結(jié)構(gòu)均有改善，實驗結(jié)果表明，蝦青素能成為改善絕經(jīng)后糖尿病患者骨質(zhì)流失的有開發(fā)前景的藥物。

骨轉(zhuǎn)化生物標志物(bone turnover biomarkers, BTMs)能夠反映骨形成和骨吸收的情況，并提供骨重塑的狀態(tài)[13]。BTMs包括骨形成和吸收標志物。骨形成生物標志物是由成骨細胞合成的，因此可以反映了特定的成骨細胞功能，包括ALP、骨鈣素和PINP[14]。在本研究中，骨形成生物標志物(ALP、osteocalcin、PINP)在OVX/T1DM大鼠血清中比對照組增加了，可能是由于活躍的成骨細胞試圖彌補由于雌激素和胰島素消耗而造成的骨質(zhì)流失。骨吸收標志物包括CTX-I和TRACP 5b，這兩者水平的升高與女性骨密度呈負相關(guān)[15]。在本研究中，去卵巢糖尿病組大鼠體內(nèi)兩種骨形成標志物(ALP、osteocalcin、PIPN)和骨吸收吸收(CTX-I、 tracp5b)標志物均增加，表明骨轉(zhuǎn)化速度加快；在OVX/T1DM-ASX組中，這些BTMs數(shù)據(jù)都比OVX/T1DM組大鼠的數(shù)據(jù)有了明顯的改善。綜上所述，本研究所獲得的數(shù)據(jù)表明蝦青素能通過抑制骨轉(zhuǎn)換的增加，改善了結(jié)合雌激素缺乏和糖尿病引起的骨質(zhì)量下降。

以往的研究表明，骨髓脂肪細胞數(shù)量是一種替代指標，可以估計骨質(zhì)疏松癥的嚴重程度[16]。更多的骨髓脂肪細胞與骨骼脆性的增加[17]是密切相關(guān)的。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)去卵巢糖尿病大鼠骨髓脂肪細胞增多，平均脂肪細胞直徑(μm)增加。這種改變沒有出現(xiàn)在OVX/T1DM-ASX組。成骨細胞和脂肪細胞在骨髓[18]中有共同的起源，OVX/T1DM大鼠體內(nèi)BMD的降低可能是由于骨髓間充質(zhì)干細胞優(yōu)先分化為脂肪細胞(而不是成骨細胞)。蝦青素治療可逆轉(zhuǎn)OVX/T1DM大鼠骨髓的脂肪生成，成骨細胞增多，這有助于降低骨質(zhì)流失。

越來越多的研究[19]表明OPG/RANKL軸在骨重建中發(fā)揮重要的作用。低比例的OPG/RANKL標志著骨吸收過程的增加。絕經(jīng)后，雌激素缺乏會使骨微環(huán)境中RANKL水平增加，而卵泡促激素(FSH)增加會導(dǎo)致T細胞活化增強，活化的T細胞促進RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞的激活和骨流失的增加。實驗證明，去勢大鼠雌激素水平降低，OPG基因表達減少，RANKL基因表達增加，破骨細胞數(shù)量增加，骨密度減少[20]。因此，OPG/RANNKL的比值對于保持絕經(jīng)后糖尿病病人的骨量是非常重要的。在本研究中，蝦青素治療60 d后，與OVX/T1DM大鼠相比，用藥組大鼠血清OPG升高、RANKL降低。骨組織中OPG和RANKL的mRNA和蛋白表達與血清中有相似的變化規(guī)律。這些結(jié)果表明蝦青素可以預(yù)防卵巢切除和糖尿病上調(diào)OPG/RANKL比值誘導(dǎo)骨量丟失。我們的研究支持蝦青素的骨保護作用，并為蝦青素在預(yù)防絕經(jīng)后糖尿病婦女骨質(zhì)流失方面的潛在治療用途提供了初步證據(jù)。