何琪 楊均政 張罡瑜 潘兆豐 蘇麗君 王海彬 陳鵬*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

隨著我國人口老齡化問題的日益嚴(yán)峻及生活方式的改變，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP) 已成為常見的危害人類健康的兩大慢性代謝性增齡性疾病[1]。目前，大量基礎(chǔ)和臨床研究均表明T2DM和OP的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，長期處于高血糖狀態(tài)會引起骨代謝紊亂，最終導(dǎo)致糖尿病性骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis，DOP)[2]。DOP主要表現(xiàn)為骨量低、骨脆性增加、骨質(zhì)量下降和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重降低了患者的生存質(zhì)量，給社會、醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)、家庭造成沉重負(fù)擔(dān)[3]。

瘦素(leptin)是一個(gè)主要由白色脂肪組織分泌的具有146個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[4]，其功能主要是抑制食欲和調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝[5]。最開始，瘦素僅僅被認(rèn)為在下丘腦中樞水平作為一個(gè)飽感因子介導(dǎo)食物攝入量減少，并增加能量的消耗[6-7]。但當(dāng)前許多研究發(fā)現(xiàn)，瘦素涉及生殖功能、血管生成或骨生長等多種生理進(jìn)程的控制[6,8-9]?，F(xiàn)有研究證實(shí)瘦素受體的分布除下丘腦外，還廣泛存在于許多組織，骨骼系統(tǒng)就是其重要的作用部位。且隨著研究的深入，瘦素受體的信號傳導(dǎo)形式已經(jīng)在多種骨骼細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)，包括骨髓間充質(zhì)細(xì)胞[10]、成骨細(xì)胞[11]、造血干細(xì)胞[12]等。而db/db小鼠是Leptin受體基因缺陷導(dǎo)致的先天性2型糖尿病小鼠，是由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室于1966年在C57BL/Ks小鼠上發(fā)現(xiàn)的帶有糖尿病突變基因(db)的動(dòng)物[13]，db/db小鼠的2型糖尿病綜合征與2型糖尿病患者相似，表現(xiàn)為肥胖、胰島素抵抗、高胰島素血癥和進(jìn)行性高血糖。由于T2DM引起的骨質(zhì)疏松癥的潛在機(jī)制尚不清楚，我們擬通過Micro-CT檢測db/db小鼠和正常野生型小鼠的脛骨近端，以期了解瘦素受體缺乏的2型糖尿病小鼠骨代謝的表型變化，從而加深對糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制的研究，明確糖尿病與骨質(zhì)疏松的認(rèn)識，對預(yù)防和治療糖尿病性骨質(zhì)疏松有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本準(zhǔn)備

選擇6周齡雄性野生型C57BL/6 J小鼠及db/db小鼠(瘦素受體缺乏小鼠)各10只，購置南京大學(xué)模式動(dòng)物所。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物設(shè)施，飼養(yǎng)環(huán)境維持恒溫(22～25 ℃)，濕度55 %～60 %，自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)和操作程序經(jīng)所在單位的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審核通過。(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：SCXK(蘇)2018-0008)動(dòng)物喂養(yǎng)8周，在14周齡時(shí)過量麻醉處死，分離左腿脛骨，盡量清除干凈周圍軟組織，然后置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.2 Micro-CT原理掃描方法

所有標(biāo)本采用Skyscan1172 micro-CT設(shè)備進(jìn)行掃描(Skyscan，Bruker，Belgium)。掃描前，將樣品從4 %多聚甲醛溶液中取出并用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，pbs)沖洗后，將骨標(biāo)本置于垂直于掃描軸的直徑為10 mm的標(biāo)本管中，周圍填塞少許醫(yī)用紗條，加入70 %乙醇作為掃描介質(zhì)。掃描儀的基本參數(shù)為：電壓50 kV，電流200 μA，總旋轉(zhuǎn)角360 °，旋轉(zhuǎn)角增量0.4 °，厚度9 μm。掃描后，使用Skyscan NRecon軟件并利用Feldkamp圓錐束算法，將二維圖像序列自動(dòng)重建為15.9 μm各向同性體素大小的三維體。脛骨骨小梁微結(jié)構(gòu)分析，選用高度為1.0 mm的VOI(the volume of interest)，分析從脛骨近端生長板下方0.45 mm處開始延伸至近端1.0 mm處。另取同樣高度的VOI，分析脛骨中骨干的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)。骨小梁參數(shù)分析，包括骨小梁相對體積(BV/TV，%)、骨表面積組織體積比值(BS/TV，1/mm)、骨小梁厚度(Tb.Th，mm)、骨小梁數(shù)量(Tb.N，1/mm)、骨小梁分離度(Tb.Sp，mm)、骨結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure model index，SMI)。通過分析骨皮質(zhì)厚度(Ct.Th，μm)、骨皮質(zhì)面積(Ct.Ar，mm2)，評估皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)。以上數(shù)據(jù)的操作和分析都使用Custom Analysis程序 (CTAn,Skyscan)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

據(jù)圖1、圖2示，與正常野生型小鼠(WT)相比，db/db小鼠的脛骨近端三維成像顯示，骨皮質(zhì)變薄、骨量相對減少、骨小梁松散且結(jié)構(gòu)呈“桿狀”變化；據(jù)圖3、圖4示，比較WT組，db/db小鼠的骨小梁、皮質(zhì)骨參數(shù)發(fā)生了顯著變化，骨小梁相對體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)明顯增大，小梁骨質(zhì)量和小梁骨連接性明顯降低，并且小梁骨微結(jié)構(gòu)惡化，小梁骨間距(Tb.Sp)相應(yīng)增加，皮質(zhì)骨厚度(Ct.Th)、橫截面積(Ct.Ar)減小，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。db/db小鼠的脛骨近端骨小梁結(jié)構(gòu)模式指數(shù)(structure model index, SMI)較野生型明顯增大，意味著小梁結(jié)構(gòu)組成中板層結(jié)構(gòu)和桿狀結(jié)構(gòu)的比例發(fā)生了改變。如果結(jié)構(gòu)中骨小梁主要為板層結(jié)構(gòu)，那么SMI接近于0；反之，如果主要是桿狀骨小梁，SMI則接近3[14]。當(dāng)發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，骨小梁結(jié)構(gòu)從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，該值增大。這一參數(shù)與圖1、圖2三維成像相符合，表明db/db小鼠中骨小梁相比野生型已轉(zhuǎn)為更多的“桿狀”結(jié)構(gòu)，發(fā)生了骨質(zhì)疏松。

圖1 野生型(WT)和db/db小鼠脛骨近端冠狀切面三維模型Fig.1 Wild-type (WT) and db/db mice coronal section 3 d models of proximal tibia

注：*P<0.05，****P<0.0001。圖2 a 野生型(WT)小鼠脛骨近端骨小梁；b db/db小鼠脛骨近端骨小梁；c 野生型(WT)小鼠脛骨近端皮質(zhì)骨；d db/db小鼠脛骨近端皮質(zhì)骨Fig.2 a. Proximal tibial trabecula in wild-type (WT) mice；b. db/db mouse proximal tibial trabecular bone; c. Cortical bone of proximal tibia in wild-type (WT) mice; d. Proximal tibial cortical bone in db/db mice

3 討論

瘦素是脂肪細(xì)胞的主要激素產(chǎn)物，參與調(diào)節(jié)食欲和能量代謝，從而影響脂肪沉積和體重[15]。越來越多的證據(jù)報(bào)道了瘦素參與了體外和體內(nèi)對骨骼和骨細(xì)胞的合成代謝，最近已有研究證實(shí)成骨和軟骨細(xì)胞也能夠合成和分泌瘦素[16-17]，瘦素能夠在中央和外周調(diào)節(jié)骨生成[18-20]。Holloway等[21]的研究證明瘦素通過RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)抑制破骨細(xì)胞的形成及功能。此外，Thomas等[22]研究發(fā)現(xiàn)，瘦素可作用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞, 促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化, 同時(shí)抑制該細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。這些結(jié)果提示瘦素可能在骨科疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。然而瘦素受體缺乏所致的骨表型仍然存在爭議，如Ducy等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在瘦素受體缺陷(db/db) 的小鼠中表現(xiàn)為骨形成增加及骨礦質(zhì)沉積速率增加，且骨密度比野生型高2～3倍，他們認(rèn)為瘦素可能通過中樞性作用方式有效抑制骨形成作用。但許多隨后的研究報(bào)道了與該假說相矛盾的發(fā)現(xiàn)，Ealey等[24]、He等[25]發(fā)現(xiàn)db/db小鼠表現(xiàn)出肢體骨量、機(jī)械強(qiáng)度和骨形成的顯著降低，隨后Williams等[26]通過Micro-CT進(jìn)一步證明了db/db小鼠脛骨的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)受損，椎骨的松質(zhì)和皮質(zhì)骨厚度降低，且與野生型(WT)小鼠相比，db/db小鼠的骨形成率也顯著下降。由于db/db小鼠骨表型矛盾的結(jié)果我們決定使用微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(μCT)檢查小鼠的骨骼。高分辨率Micro-CT優(yōu)于傳統(tǒng)的雙能X線骨密度儀和組織形態(tài)學(xué)檢測方法，因?yàn)樗軌蛞晕⒚追直媛蚀_定骨骼的3D微觀結(jié)構(gòu)，是一種更快速、更準(zhǔn)確、又不損傷樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有效的檢查方法[27]，尤其是在小動(dòng)物標(biāo)本和大型動(dòng)物離體標(biāo)本的研究領(lǐng)域，Micro-CT已經(jīng)成為評價(jià)骨形態(tài)和骨微結(jié)構(gòu)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[28]。

圖3 野生型(WT)和db/db小鼠脛骨近端骨小梁參數(shù)Fig.3 Parameters of proximal tibial trabecular bone in WT and db/db mice: BV/TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp, BS/TV and SMI

注：*P<0.05，****P<0.0001。圖4 野生型(WT)和db/db小鼠脛骨近端皮質(zhì)骨參數(shù)Fig.4 Parameters of proximal tibial cortical bone in wild-type (WT) and db/db mice

在本研究中，我們通過高分辨率的Micro-CT對14周齡的db/db小鼠和正常野生型小鼠的脛骨進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，db/db小鼠的脛骨表現(xiàn)為骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度及皮質(zhì)骨厚度的明顯減小，脛骨骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞，這與Jing等[29]的發(fā)現(xiàn)相一致。另外，我們還以三角形骨表面辨別分析為基礎(chǔ)通過三維分析方法計(jì)算獲得結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)[30]，發(fā)現(xiàn)其與野生型小鼠相比增大，表示骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，說明了db/db小鼠脛骨已發(fā)生骨質(zhì)疏松。因此，我們的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，在2型糖尿病小鼠的四肢中可觀察到骨微結(jié)構(gòu)的顯著惡化和骨強(qiáng)度的降低。

2型糖尿病所引起的骨質(zhì)疏松是糖尿病在骨骼系統(tǒng)的重要并發(fā)癥，也是成為糖尿病患者軀體骨骼長期疼痛和功能障礙的主要原因[31]。DOP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、影響因素較多，涉及到多個(gè)通路的互相作用，且針對其的治療手段又十分有限，因此探討2型糖尿病與骨質(zhì)疏松癥間的關(guān)系以及影響因素已成為目前學(xué)界研究的熱點(diǎn)問題之一。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要包括高血糖、胰島素相對或絕對缺乏、糖尿病微血管病變、激素水平異常等[32]。其中激素水平異常可能是由于瘦素的影響，有臨床觀察[33]顯示，2型糖尿病患者早期血清瘦素水平較高，表現(xiàn)為瘦素抵抗，因此2型糖尿病造成的骨質(zhì)疏松可能與瘦素抵抗有一定的相關(guān)性，這與我們觀察到的db/db小鼠的骨表型相吻合。

一般骨質(zhì)疏松以骨強(qiáng)度下降為特點(diǎn)，其診斷主要依靠雙能X線吸收法測定骨密度。然而，由于DOP患者早期癥狀不明顯[34]，且通常以低骨轉(zhuǎn)換性骨質(zhì)疏松為特點(diǎn)，成骨細(xì)胞活性下降，骨修復(fù)能力受損，有些與骨強(qiáng)度相關(guān)的因素如骨微結(jié)構(gòu)在骨密度檢測中測不出，骨密度對于預(yù)測糖尿病患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)具有局限性，因此，對DOP的早期診斷方法還有待進(jìn)一步研究。Samelson等[35]通過高分辨率外周定量 CT掃描(high resolution peripheral quantitative CT，HR-pQCT)對1 069例社區(qū)人群進(jìn)行研究，結(jié)果顯示與非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者脛骨骨微結(jié)構(gòu)損傷，皮質(zhì)骨骨厚度下降，橫截面積更小，這與本研究中我們觀察到的2型糖尿病小鼠中皮質(zhì)骨厚度(Ct.Th)、橫截面積(Ct.Ar)減小，SMI指數(shù)升高，骨微結(jié)構(gòu)受損相符，表明高分辨率外周定量CT掃描可能成為早期診斷DOP的金標(biāo)準(zhǔn)，且db/db小鼠在骨微結(jié)構(gòu)水平上，可能成為與2型糖尿病(T2DM)相關(guān)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的潛在動(dòng)物模型。

但我們目前的研究也有一些局限性。首先，由于小鼠股骨頸測量困難，我們改用脛骨近端進(jìn)行μCT掃描，我們的結(jié)果可能不適用于骨折部位在股骨的2型糖尿病患者[36]。其次，我們沒有通過血液樣本或骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)對骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志進(jìn)行評估，無法觀察到動(dòng)物模型骨代謝平衡的根本變化。最后，由于目前研究使用的評估技術(shù)的局限性，骨微結(jié)構(gòu)的一些特征如皮質(zhì)孔隙率，一個(gè)基質(zhì)的微裂紋或骨的非礦物質(zhì)相關(guān)特性不能被檢測。

總之，本研究顯示了2型糖尿病小鼠的四肢骨小梁和皮質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)顯著惡化，全骨結(jié)構(gòu)特性下降。我們的研究證明了，在缺乏瘦素信號傳導(dǎo)的情況下，骨質(zhì)量和強(qiáng)度會降低，驗(yàn)證了瘦素在體內(nèi)起著合成代謝骨因子的作用。這也與體外研究和體內(nèi)給藥的結(jié)果相吻合，也表明瘦素對骨細(xì)胞的直接促進(jìn)作用可能會抵消其通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。由于瘦素不僅在骨骼代謝中起著重要的作用，而且還影響著2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，因此我們通過上述實(shí)驗(yàn)，認(rèn)識到db/db小鼠骨代謝的變化，明確了2型糖尿病與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系，而且認(rèn)為2型糖尿病所引起的骨代謝變化可能與瘦素受體參與的信號通路相關(guān)，為DOP的研究方向提供了更具體的分子基礎(chǔ)，打開了新的思路和視角，也為以后雙聯(lián)給藥和精準(zhǔn)醫(yī)療埋下了“伏筆”。但目前國內(nèi)外關(guān)于該方面的研究相對局限，如瘦素是否參與Wnt/β-catenin和OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)等經(jīng)典信號通路對成骨、破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)，具體是如何對下游基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起調(diào)控作用仍不完全清楚。相信隨著研究的深入，瘦素在2型糖尿病、骨代謝中的作用以及骨細(xì)胞上的瘦素受體在其分化轉(zhuǎn)歸中的調(diào)控將進(jìn)一步揭示骨-脂代謝偶聯(lián)在骨發(fā)育及干細(xì)胞調(diào)控中的作用，并作為潛在靶點(diǎn)為臨床治療糖尿病與骨代謝疾病提供新思路。