王玥 劉啟玲 徐守竹 田敏敏 張蓓 張榮強(qiáng) 孫娜 史傳道

陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量、骨基質(zhì)和骨小梁數(shù)量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致的以骨脆性增加為特征的全身代謝障礙性疾病[1]。其發(fā)病率高，病程長(zhǎng)，常伴有嚴(yán)重并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，70 %以上的病理性骨折由OP引起，進(jìn)而增加死亡率(20 %～24 %)和致殘率(40 %)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[2]。目前，我國(guó)OP發(fā)病率高達(dá)7 %，預(yù)計(jì)到2050年我國(guó)OP和低骨量患者將增至3億[3]。

骨骼處于骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，就可引起骨穩(wěn)態(tài)失衡，最終發(fā)生OP[4]。骨穩(wěn)態(tài)的維持需要成骨細(xì)胞(OB)、破骨細(xì)胞(OC)和骨細(xì)胞等多種細(xì)胞、激素、因子的密切配合[5]。絕經(jīng)后，由于雌激素減少引起骨量丟失增加，骨生成減少，骨穩(wěn)態(tài)被破壞。自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制[6]。有研究顯示，自噬參與調(diào)節(jié)OP的病理過(guò)程，對(duì)維持骨穩(wěn)態(tài)具有重要意義[7]。細(xì)胞中充當(dāng)能量傳感器的AMP依賴(lài)蛋白激酶(AMPK)可調(diào)節(jié)自噬水平[8]，其下游分子mTOR激酶是自噬過(guò)程中的關(guān)鍵分子，AMPK通過(guò)磷酸化mTORC1的調(diào)控元件或磷酸化TSC2蛋白兩種途徑抑制mTOR信號(hào)通路，故AMPK的活化，可抑制mTOR活性，進(jìn)而解除mTOR對(duì)自噬的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)骨形成[9]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，抑制自噬相關(guān)蛋白Atg5后，OB的增殖和分化亦受到抑制。且敲除OB中Atg7，可降低骨自噬水平，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，ALP、Runx2等成骨分化標(biāo)志物表達(dá)降低，骨基質(zhì)礦化減少，細(xì)胞凋亡增加。以上研究均表明自噬有助于維持成骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

目前，臨床治療OP的藥物致癌、致畸、骨壞死等不良反應(yīng)極大[11]。中藥相對(duì)安全、不良反應(yīng)少，且多種有效成分進(jìn)行配伍后可多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)。課題組前期通過(guò)4次臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗疏健骨顆?？娠@著提高OP臨床療效[12-13]。本研究通過(guò)摘除大鼠雙側(cè)卵巢，復(fù)制絕經(jīng)后OP模型，用不同劑量抗疏健骨顆粒進(jìn)行干預(yù)后，檢測(cè)成骨、破骨標(biāo)志物及自噬相關(guān)蛋白，闡明抗疏健骨顆粒改善OP與調(diào)節(jié)自噬水平的關(guān)系。該機(jī)制的闡明對(duì)深入認(rèn)識(shí)OP發(fā)生機(jī)理，臨床運(yùn)用抗疏健骨顆粒治療OP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及藥物

60只雌性SPF級(jí)SD大鼠，3～4月齡，體重180～220 g，購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證明：SCXK(陜)2019-001。本研究經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

抗疏健骨顆粒由陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究實(shí)驗(yàn)室制備，高溫封瓶(1 g顆粒劑相當(dāng)于10.15 g生藥)，4 ℃保存?zhèn)溆?，用時(shí)采用蒸餾水稀釋成不同濃度用于實(shí)驗(yàn)。配方為：淫羊藿15 g、杜仲12 g、牛膝12 g、白術(shù)20 g、丹參10 g。

1.2 主要試劑

大鼠G蛋白偶聯(lián)受體48(GPR48)ELISA試劑盒(BG公司)，大鼠轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)ELISA試劑盒(AMEKO公司)，ALP、BGP和TRACP試劑盒(Abcom 公司)，AMPK、LC3-II、Beclin-1和P62抗體(Pierce 公司)，β-actin抗體、DAB、BCA試劑盒和辣根酶標(biāo)記二抗(上海如吉生物科技公司)。

1.3 主要儀器及設(shè)備

平行電泳儀(Eps 100，Tanon公司)，半干轉(zhuǎn)儀(Tans-biot SD Cell，Bio-RAD)，凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ，Bio-RAD)，凝膠分析系統(tǒng)(GZS-2010，Tanon)，全波段酶標(biāo)儀(M200 PRO，TECAN公司)，KHF-524組織切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)，DM4000B生物顯微鏡(日本Olympus公司)，自動(dòng)恒溫?cái)偪竞嫫瑱C(jī)(GTK-2002、西安瑞豐)，制冰機(jī)(BL20，Barline)，石蠟切片機(jī)(RM2015，Leica)。

1.4 動(dòng)物分組與骨質(zhì)疏松模型的建立

60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為5組(12只/組)，即假手術(shù)組、模型組、抗疏健骨顆粒低、中、高干預(yù)組。用10 %水合氯醛進(jìn)行麻醉后，對(duì)大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型。其中假手術(shù)組找到左右大網(wǎng)膜后，選取與雙側(cè)卵巢重量相近的大網(wǎng)膜進(jìn)行切除，剩余處置完全與其他各組相同，1周后拆線。手術(shù)12周后，隨機(jī)抽取模型組大鼠分離股骨，病理切片顯示有骨質(zhì)疏松癥病理改變后，進(jìn)行后續(xù)的藥物干預(yù)研究。動(dòng)物飼養(yǎng)為12 h明/12 h暗交替，(22±2) ℃常溫正常飼養(yǎng)于籠中，自由飲食。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥

參考《中藥藥理研究方法學(xué)》[14]，根據(jù)人和大鼠的計(jì)量折算系數(shù)確定所給藥量。其中，假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水灌胃；抗疏健骨顆粒三個(gè)劑量組分別為：低[0.287 g/(kg·d)]、中[0.573 g/(kg·d)]和高[1.146 g/(kg·d)]。每日清晨經(jīng)口灌胃給藥，6次/周，共12周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周稱(chēng)重調(diào)整灌胃劑量。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)：隨機(jī)選取假手術(shù)組、模型組大鼠6只，每只大鼠制作3張病理切片。具體為剔除大鼠右側(cè)股骨肌肉及筋膜，保留骨膜。取股骨遠(yuǎn)端，置于10 %福爾馬林固定液24 h，再將其置于10 %EDTA脫鈣液，每日更換脫鈣液，直至大頭針可輕輕刺入，HE染色后，光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)改變情況。

1.6.2血清學(xué)檢測(cè)：給藥12周后，各組動(dòng)物禁食12 h，注射10 %水合氯醛(0.4 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈采血，4 ℃下1 500 r/min離心5 min，制備血清，采用ELLSA法按說(shuō)明書(shū)規(guī)范檢測(cè)骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)水平。

1.6.3股骨破骨、成骨水平檢測(cè)：采用ELLSA法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定骨組織中G蛋白偶聯(lián)受體-48(GPR48)、轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)含量表達(dá)情況。

1.6.4自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)：用Western blotting法檢測(cè)股骨中自噬上游分子AMPK、自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1和p62蛋白表達(dá)情況。取事先備好的股骨碎片200 mg，在含有液氮的研缽中充分研磨至粉末，小心收集骨粉末入勻漿管內(nèi)，加入2 mL預(yù)冷裂解液(RIPA裂解液∶抑制劑∶PMSF=100∶1∶1)，待組織完全裂解后，勻漿兩次，將勻漿液轉(zhuǎn)至離心管，冰上沉淀30 min后離心 (3 000 r/min，25 min)。取勻漿上清液入EP管，其中吸出20 μL上清液用于BCA蛋白定量(BCA工作液A∶B=50∶1)，剩余部分加入Loading Buffer，100 ℃煮沸8 min后放至室溫，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱用于WB測(cè)定。WB檢測(cè)的具體步驟為：配膠→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→孵一抗→洗膜、孵二抗→洗膜、發(fā)光。具體條件：濕式電泳儀轉(zhuǎn)膜300 mA、60 min；5 %脫脂牛奶室溫下封閉1 h；Ⅰ抗和內(nèi)參4 ℃孵育16 h；二抗(抗兔IgG)室溫下孵育1 h，ECL顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

采用HE染色檢測(cè)骨質(zhì)疏松模型建立情況。假手術(shù)組骨髓腔較小，骨小梁數(shù)量較多且粗壯，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨小梁有成骨細(xì)胞排列。模型組骨髓腔增大，骨小梁變細(xì)出現(xiàn)斷裂，數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)紊亂且不完整，骨外膜少見(jiàn)骨原細(xì)胞。如圖1。

圖1 假手術(shù)組與模型組HE染色鑒定骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建情況假手術(shù)組(×4)假手術(shù)組(×40)；模型組(×4) 模型組 (×40)Fig.1 Assessment the osteoporosis models of the ovariectomy in Sham and Model groups

2.2 各組大鼠血清中ALP含量比較

與假手術(shù)組相比，模型組血清ALP明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；三個(gè)用藥組與模型組相比，ALP水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，中劑量組ALP水平最低(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中ALP含量比較

2.3 各組大鼠血清中BGP、TRACP水平比較

與假手術(shù)組相比，模型組血清中BGP、TRACP水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抗疏健骨顆粒三個(gè)劑量組均可以降低血清中BGP、TRACP水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中劑量組對(duì)兩個(gè)指標(biāo)降低的平均值最小。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清BGP、TRACP水平的比較

2.4 各組大鼠股骨GPR48、ATF4含量比較

與假手術(shù)組相比，模型組骨組織中GPR48和ATF4均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，抗疏健骨顆粒三個(gè)劑量組均可以升高骨GPR48和ATF4含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且GPR48高劑量組升高值最大，而ATF4低劑量組升高最多，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠骨組織GPR48、ATF4含量比較

2.5 各組骨組織AMPK蛋白的比較

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組大鼠骨組織p-AMPK與t-AMPK比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高三個(gè)劑量組均可升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果如圖2。mTOR上游蛋白AMPK表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)抗疏健骨顆粒可提高AMPK磷酸化水平(圖4)，激活A(yù)MPK。

注：A 假手術(shù)組，B 模型組，C 低劑量治療組，D 中劑量治療組，E 高劑量治療組。*P<0.05。圖2 抗疏健骨顆粒對(duì)股骨AMPK的影響Fig.2 The effect of Kangshujiangu Granules on femoral AMPK

注：A 假手術(shù)組，B 模型組，C 低劑量治療組，D 中劑量治療組，E 高劑量治療組。* P<0.05。圖3 抗疏健骨顆粒對(duì)自噬相關(guān)蛋白的作用Fig.3 The effect of Kangshujian Granules on autophagy-related proteins in Femur tissues

2.6 各組骨組織自噬相關(guān)蛋白的比較

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組大鼠骨組織LC3-Ⅱ、Beclin1的相對(duì)灰度值下降，P62相對(duì)灰度值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高三個(gè)藥物劑量組LC3-Ⅱ、Beclin1的相對(duì)灰度值升高，P62相對(duì)灰度值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果如圖3。

3 討論

OP是骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡被打破而發(fā)生。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最常見(jiàn)的OP。自噬可調(diào)控骨骼穩(wěn)態(tài)。一旦自噬異常，會(huì)導(dǎo)致受損分子和細(xì)胞器過(guò)度積累，誘發(fā)一些疾病，包括OP[15]。

目前，臨床治療OP的主要策略是降低骨吸收或促進(jìn)骨形成，但使用的藥物往往伴有明顯的不良反應(yīng)。如被廣為使用的雙膦酸鹽類(lèi)藥物可出現(xiàn)非典型股骨頭骨折和下頜骨壞死兩種嚴(yán)重并發(fā)癥[16]。雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑可顯著降低脊椎、非脊椎和髖部骨折，但可明顯引起乳腺癌、冠狀動(dòng)脈和腦血管的血栓形成。因此，亟需尋找安全性高、療效廣泛的治療OP的臨床藥物。中醫(yī)學(xué)把骨質(zhì)疏松歸為“骨枯”、“骨痿”、“骨痹”范疇，認(rèn)為腎虛是骨質(zhì)疏松的主要病機(jī)，脾虛是骨質(zhì)疏松的重要因素，血瘀是骨質(zhì)疏松的加重或促進(jìn)因素。現(xiàn)代中醫(yī)藥治療OP，有單味中藥、中藥復(fù)方和針灸推拿等多種方式[17]?？故杞」穷w粒是在總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上，結(jié)合藥學(xué)實(shí)驗(yàn)研發(fā)而成，主要功能是補(bǔ)腎健脾、活血壯骨。主要成分為淫羊藿、杜仲、牛膝、白術(shù)和丹參5味中藥。

摘除卵巢法建立OP模型與成年女性O(shè)P臨床癥狀高度相似，是公認(rèn)的OP模型[20]。本研究中模型組股骨病理切片較假手術(shù)組骨髓腔變大，骨小梁變細(xì)并出現(xiàn)斷裂，表明此動(dòng)物模型建立成功。骨代謝標(biāo)志物可體現(xiàn)骨形成與骨吸收之間骨代謝的特點(diǎn)與水平，是評(píng)估骨質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。ALP升高是OP發(fā)生的重要指標(biāo)[18]。本研究結(jié)果與以往研究一致，模型組ALP值升高，抗疏健骨顆粒三個(gè)用藥組可降低ALP水平，從動(dòng)物學(xué)角度證明抗疏健骨顆粒對(duì)改善OP具有一定作用。骨鈣素(BGP)由成骨細(xì)胞(OB)分泌產(chǎn)生，反映OB活性，是骨形成的特異性指標(biāo)。本研究顯示，模型組BGP顯著高于假手術(shù)組和抗疏健骨顆粒三個(gè)用藥組，說(shuō)明絕經(jīng)后OP是高轉(zhuǎn)換型，骨更新率快，且抗疏健骨顆?？赡芡ㄟ^(guò)改善OB功能，達(dá)到治療OP的作用。血清中TRACP是骨吸收和破骨細(xì)胞活性的良好標(biāo)志物，OP時(shí)往往升高[19]。本研究顯示，模型組TRACP水平顯著高于假手術(shù)組，三個(gè)用藥組較模型組平均值有所降低，說(shuō)明抗疏健骨顆?？赡茏饔糜谄乒羌?xì)胞(OC)，但下降平均值僅為1.7 pg/L，是否具有現(xiàn)實(shí)臨床意義尚有待進(jìn)一步研究。

GPR48可調(diào)節(jié)下游信號(hào)ATF4基因的表達(dá)，ATF4在成骨細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。ATF4缺陷鼠表現(xiàn)出科勒綜合征(CLS)的骨骼表現(xiàn)型，即身材矮小、骨齡延遲、囟門(mén)閉合延遲、骨量減少、牙發(fā)育異常。成骨細(xì)胞蛋白合成能力下降，Ⅰ型膠原合成減少[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組GPR48和ATF4含量顯著低于假手術(shù)組，而抗疏健骨顆粒三個(gè)劑量組均可升高GPR48和ATF4水平。說(shuō)明抗疏健骨顆粒能夠在一定程上改善GPR48和ATF4相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，扭轉(zhuǎn)OP引起的骨代謝失衡，也進(jìn)一步證明中醫(yī)補(bǔ)腎之法可以改變OP的內(nèi)在生物學(xué)病理變化。

AMPK是一種進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在分解代謝上調(diào)和合成代謝失活中起關(guān)鍵作用?；罨腁MPK調(diào)節(jié)多種代謝過(guò)程，特別是自噬。故我們測(cè)定了股骨中AMPK及其下游的自噬相關(guān)蛋白水平，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組對(duì)比，模型組大鼠骨組織p-AMPK與t-AMPK比值下降，而抗疏健骨顆?？缮哌@一比值，提示抗疏健骨顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)AMPK，進(jìn)而影響自噬，達(dá)到治療OP的作用。這一提示通過(guò)測(cè)定股骨中自噬標(biāo)志蛋白Beclin1、LC3-II和P62水平得到驗(yàn)證，結(jié)果顯示，模型組大鼠股骨中的Beclin1和LC3-Ⅱ的相對(duì)灰度值較假手術(shù)組下降，而P62相對(duì)灰度值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與模型組相比，低、中、高三個(gè)藥物劑量組均可升高LC3-Ⅱ和Beclin1水平，降低P62含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這進(jìn)一步證明抗疏健骨顆?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)自噬水平，改善OP癥狀。

綜上，抗疏健骨顆?？烧{(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清及骨組織中骨代謝水平；增加AMPK磷酸化水平，加強(qiáng)AMPK對(duì)下游因子mTOR的抑制作用，使mTOR對(duì)自噬的抑制作用減輕，骨組織自噬水平增加，促進(jìn)骨生成，進(jìn)而調(diào)解骨穩(wěn)態(tài)，這可能是抗疏健骨顆粒治療OP的主要機(jī)制。