石 敏，雍 琴，何穎娜，黃仕琴，趙 軒，余 嫻*

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗研究室，重慶400010；2河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，石家莊050200；3重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院，重慶402260）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種機(jī)會性致病菌，可造成機(jī)體的嚴(yán)重感染，尤其是在醫(yī)療機(jī)構(gòu)及免疫功能低下的人群中［1］，可引起局部感染（如呼吸道、泌尿道、胃腸道、眼睛、皮膚和關(guān)節(jié)）或全身性菌血癥［2］。由于PA對大多數(shù)抗生素都存在耐藥性［3］，臨床治療PA感染顯得十分棘手，研發(fā)PA疫苗是解決這一治療困境的一種有前景的策略。

PA相關(guān)疫苗研究已發(fā)展幾十年，到目前為止，研究的候選疫苗抗原包括脂多糖、多糖、多糖結(jié)合物、鞭毛、外膜蛋白、Ⅲ型分泌系統(tǒng)等，此外PA疫苗的減毒活疫苗及滅活疫苗亦有研究［4］。不少疫苗在前期動物模型取得不錯的免疫反應(yīng)并進(jìn)入了臨床試驗［2］，然而目前仍無PA疫苗可以用于臨床。外膜蛋白F（outer membrane protein F，OprF）在不同菌株中高度保守［5］，且與群體感應(yīng)、毒素分泌和細(xì)胞黏附有關(guān)［6］，因而是PA最有希望的候選抗原疫苗之一［7］。本課題組前期構(gòu)建的PA OprF DNA疫苗（pVAX1-OprF-VP22）證實其具有良好的免疫原性，在動物體內(nèi)可引起體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)［8］。

DNA疫苗具有易生產(chǎn)、價格合理、熱穩(wěn)定、安全可靠且不存在減毒疫苗毒力回升風(fēng)險等優(yōu)點［9］，因而備受研究者青睞。目前已有DNA疫苗進(jìn)入臨床試驗階段，部分DNA疫苗已被批準(zhǔn)用于動物疾病的防治［10］。盡管DNA疫苗優(yōu)勢明顯，但因其在體內(nèi)易被核酸酶降解、抗原提呈細(xì)胞攝取率低［11］，誘發(fā)的免疫效力有限，如何提高DNA疫苗免疫原性是亟需解決的難題，迄今尚無DNA疫苗應(yīng)用于臨床治療。水凝膠是一種高分子聚合物形成的網(wǎng)絡(luò)體系，可因外界環(huán)境變化如pH、溫度、光、熱等刺激發(fā)生溶膠-凝膠相變［12］，具有良好的生物相容性、可調(diào)的多孔性及對生物流體的親和力等特性，因而廣泛應(yīng)用于藥物遞送、組織工程等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［13］。其中溫敏性可注射水凝膠因其隨溫度變化在注射部位由溶膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)的特點，可作為疫苗儲庫緩慢釋放包載的抗原，具有良好的應(yīng)用 前景。poly（d，l-lactic-co-glycolic acid）-b-poly（ethylene glycol）-b-poly（d，l-lactic-co-glycolic acid）（PLGA-PEG-PLGA）材料由于可生物降解性、生物相容性好、可控的降解速率、易于給藥、可調(diào)節(jié)的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變等優(yōu)點，廣泛用于藥物遞送等方面［14-16］，但關(guān)于其用于DNA疫苗的遞送報道較少。

本實驗擬構(gòu)建載PA DNA疫苗的PLGA-PEGPLGA溫敏性水凝膠遞送系統(tǒng)，通過皮下注射該系統(tǒng)，在體溫環(huán)境下PLGA-PEG-PLGA發(fā)生相變轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，在注射部位形成抗原儲庫可連續(xù)釋放抗原質(zhì)粒，提高機(jī)體對抗原的攝取，進(jìn)而引發(fā)更為強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，為PA DNA疫苗研發(fā)提供一種新的策略方法。

1材料

1.1 重組質(zhì)粒、OprF抗原蛋白、細(xì)胞及實驗動物

重組質(zhì)粒pVAX1-OprF-VP22（pDNA）由本實驗室保存，OprF抗原蛋白由上海生工生物有限公司合成并保存于-80℃，小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞系DC 2.4由本實驗室保存。實驗所用動物為健康雌性BALB/c小鼠（6～8周），SPF級，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物自由進(jìn)食、飲水，本研究通過重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，整個研究過程符合倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑

PLGA-PEG-PLGA［Mr：1 654（PLGA）-1 500（PEG）-1 654（PLGA），丙交酯（LA）∶乙交酯（GA）=3∶1］（濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；聚乙烯亞胺（poly?ethyleninime，PEI，美國Polysciences公司）；in vivojetPEI體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑（法國Polyplus公司）；Li?po8000轉(zhuǎn)染試劑、紅細(xì)胞裂解液、青霉素-鏈霉素溶液（100×）、胰蛋白酶溶液、牛血清白蛋白（BSA）（碧云天生物有限公司）；MEM培養(yǎng)基、NEAA（美國Gibco公司）；RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；小鼠IFN-γELISA試劑盒（瑞典Mabtech公司）；胎牛血清（FBS）（賽米克生物有限公司）；PBS溶液、CCK-8試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、單組分TMB顯色液、ELISA終止液、吐溫20（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3儀器

Varioskan LUX酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀（英國Malvern Panalytical儀器有限公司）；3-18臺式高速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；iCEN-24R低溫高速離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）；NanoDropTMone超微量紫外-分光光度計（美國Thermo公司）。

2方 法

2.1 PLGA-PEG-PLGA水凝膠制備

室溫條件下稱取一定量的PLGA-PEG-PLGA材料，溶于PBS（pH 7.4）溶液中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PLGA-PEG-PLGA溶液，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PLGA-PEG-PLGA水凝膠相變溫度及37℃凝膠時間測定

利用倒置試管法檢測相變溫度，將配制好的水凝膠及含PEI/pDNA復(fù)合物的水凝膠樣品（PLGA-PEG-PLGA終濃度為20%，pDNA質(zhì)量濃度為0.1μg/μL）置于EP管中，恒溫水浴鍋從15℃開始緩慢升溫，每升高0.5℃觀察凝膠溶液狀態(tài)，當(dāng)?shù)怪肊P管后30 s后溶液均不流動則視為水凝膠已完全凝膠化，記錄此時的溫度即為相變溫度，在相同實驗條件下測量3次取均值。同時測量37℃條件下水凝膠凝膠化所需要的時間，每隔5 s觀察一次水凝膠形態(tài)，當(dāng)溶液完全凝膠化時記錄下所需時間，相同實驗條件下測量3次取均值。

2.3 PLGA-PEG-PLGA水凝膠粒徑測定

制備20%水凝膠樣品，稀釋一定倍數(shù)后利用納米粒度電位儀（檢測溫度為25℃）檢測水凝膠自組裝形成的膠束粒徑大小。

2.4 PLGA-PEG-PLGA水凝膠細(xì)胞毒性實驗

使用MEM完全培養(yǎng)基（含10%FBS，1%NEAA，1%雙抗）培養(yǎng)DC 2.4細(xì)胞，取對數(shù)生長期的DC 2.4細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)，將細(xì)胞分組為：對照組（PBS），水凝膠組（Gel），Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑/質(zhì)粒（Lipo/pDNA）組，水凝膠+Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑/質(zhì)粒（Gel+Lipo/pDNA）組，分別加入處理因素PBS 20μL、水凝膠10μL+PBS 10μL、Lipo8000/pDNA 5μL+PBS 15μL、水凝膠10μL+Lipo8000/pDNA 5μL+PBS 5μL，Lipo8000/pDNA復(fù)合物配制方法參照說明書。每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24和48 h后吸去培養(yǎng)基，PBS潤洗2次，每孔加入含10μL CCK-8溶液的培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)孵育4 h，利用酶標(biāo)儀測450 nm處的吸收度A，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率公式為：細(xì)胞存活率=（實驗組吸收度－調(diào)零組吸收度）/（對照組吸收度－調(diào)零組吸收度）×100%。

2.5 PLGA-PEG-PLGA水凝膠體外釋放實驗

制備水凝膠、含pDNA或PEI/pDNA復(fù)合物的水凝膠（PLGA-PEG-PLGA終濃度為20%，pDNA含量為60μg），混勻后4℃靜置1 h使pDNA或PEI/pDNA復(fù)合物均勻分散于水凝膠樣品中，然后將水凝膠樣品置于37℃環(huán)境下完全凝膠化后加入PBS溶液（37℃預(yù)熱）500μL，于37℃、60 r/min恒溫振搖，于預(yù)定時間點取出全部上清液，并補(bǔ)足新鮮PBS溶液500μL，紫外分光光度法檢測上清液中質(zhì)粒的濃度。

2.6 PLGA-PEG-PLGA溫敏水凝膠體內(nèi)降解

取水凝膠200μL注射于BALB/c小鼠背部皮下，分別于注射后30 min、3 d、5 d、10 d、15 d處死小鼠，對注射部位的凝膠進(jìn)行拍照，觀察凝膠殘余體積變化情況。

2.7 動物免疫方案

將6～8周大小的健康雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組（n=3）：對照組（PBS）、水凝膠組（Hydrogel）、in vivo-jetPEI/質(zhì)粒DNA組（in vivo-jetPEI/pDNA）、水凝膠+in vivo-jetPEI/質(zhì)粒DNA組（Gel+in vivojetPEI/pDNA）。各組制劑注射于小鼠背部皮下，具體為：PBS組每只注射PBS 200μL，Hydrogel組每只注射20%水凝膠溶液200μL，in vivo-jetPEI/pDNA組每只注射含pDNA 20μg的in vivo-jetPEI/pDNA復(fù)合物溶液200μL，Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組每只注射含in vivo-jetPEI/pDNA復(fù)合物（含pDNA 20μg）的20%水凝膠溶液200μL。每隔10 d免疫1次，共免疫3次，末次免疫后2周處死小鼠。

2.8 血清特異性IgG抗體檢測

參考文獻(xiàn)［8］中的方法，利用間接ELISA法檢測血清中特異性IgG抗體。將OprF蛋白（5μg/mL）包被于96孔酶標(biāo)板中，于4℃過夜。棄去96孔板中的液體，5%BSA于37℃封閉2 h，PBST（PBS含0.1%吐溫20）洗板，加入一定倍數(shù)稀釋的血清樣本，37℃孵育1 h，PBST洗板，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育1 h，PBST洗板，加入單組分TMB顯色液，37℃避光孵育一定時間后加入ELISA終止液，于450 nm處測定吸收度。

2.9 脾淋巴細(xì)胞增殖實驗

末次免疫2周后無菌獲取各組小鼠脾臟，分離脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度每毫升2×106個細(xì)胞，每孔加細(xì)胞懸液100μL于96孔板中，每組小鼠設(shè)陰性對照（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、抗原刺激（終濃度10μg/mL OprF）、陽性對照（終濃度5μg/mL ConA）。每個處理因素設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。

2.10 IFN-γ水平檢測

按上述方法制備脾臟淋巴細(xì)胞混懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×106個細(xì)胞，每孔加細(xì)胞懸液100μL于96孔板中，用OprF蛋白（終濃度為10μg/mL）刺激各組淋巴細(xì)胞，37℃、5%CO2條件下，96孔板中培養(yǎng)72 h后收集上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平。

2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 PLGA-PEG-PLGA水凝膠具有合適的相變溫度及凝膠時間

為了驗證PLGA-PEG-PLGA水凝膠的溫敏特性，利用倒置試管法進(jìn)行判斷。圖1結(jié)果表明，在4℃時，含或不含PEI/pDNA復(fù)合物的20%PLGAPEG-PLGA水凝膠溶液均表現(xiàn)為可自由流動的溶液態(tài)，而在37℃時則表現(xiàn)為穩(wěn)定的凝膠態(tài)。檢測了PLGA-PEG-PLGA的相變溫度，結(jié)果如表1所示，含或不含PEI/pDNA復(fù)合物的20%PLGA-PEGPLGA水凝膠溶液在32℃左右時即發(fā)生溶膠-凝膠相變轉(zhuǎn)化為不能流動的凝膠，37℃時可以在2 min內(nèi)形成穩(wěn)定的凝膠態(tài)。

Figure 1 Appearance changes of the different copolymer with a con?centration of 20%at different temperatures

Table 1 Phase transition temperature and gelation time(37°C)of 20%hydrogel solution

3.2 PLGA-PEG-PLGA水凝膠粒徑

檢測20%PLGA-PEG-PLGA水凝膠溶液的粒徑發(fā)現(xiàn)其粒徑為（43.99±1.242）nm，多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.325±0.026，說明水凝膠自組裝形成的膠束粒徑分布較均一。有研究表明，PLGA-PEG-PLGA形成的膠束有助于細(xì)胞對PEI/pDNA復(fù)合物的內(nèi)吞過程，增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染效率［17］。結(jié)合水凝膠的溫敏相變特性，表明20%PLGA-PEG-PLGA水凝膠溶液可作為一種理想的材料用于抗原基因的體內(nèi)遞送。

3.3 PLGA-PEG-PLGA水凝膠體外無明顯細(xì)胞毒性

將PLGA-PEG-PLGA水凝膠溶液處理細(xì)胞24和48 h后檢測細(xì)胞活性以評估水凝膠的體外毒性。結(jié)果如圖2所示，與對照組（PBS組）相比，Gel組、Lipo8000/pDNA組及含Lipo8000/pDNA復(fù)合物水凝膠組的細(xì)胞活性無明顯差異（P＞0.05），在各組制劑處理細(xì)胞24及48 h后細(xì)胞存活率均在90%以上，說明PLGA-PEG-PLGA水凝膠的體外生物相容性良好，其負(fù)載Lipo8000/pDNA復(fù)合物后對細(xì)胞也無明顯毒性。細(xì)胞毒性結(jié)果表明空白水凝膠及負(fù)載陽離子聚合物/pDNA復(fù)合物水凝膠在體外細(xì)胞相容性良好，可進(jìn)一步用于體內(nèi)研究。

Figure2 Cytotoxicity analysis of DC 2.4 cells treated with different treatments for 24 h（A）and 48 h（B）(xˉ±s,n=3)

3.4 PLGA-PEG-PLGA水凝膠體外緩慢釋放質(zhì)粒DNA

為驗證水凝膠具有緩慢釋放質(zhì)粒DNA的作用，將pDNA及PEI/pDNA復(fù)合物分別加入水凝膠中進(jìn)行體外釋放實驗，在不同時間點檢測釋放介質(zhì)中的質(zhì)粒含量以計算水凝膠中質(zhì)粒DNA的累計釋放率。結(jié)果如圖所示，在體外釋放7 d時，PEI/pDNA組約釋放出總量的80%（圖3-B），與游離pDNA組釋放4 d時的累計釋放率相當(dāng)（圖3-A）。這說明PLGA-PEG-PLGA能很好的攜帶pDNA或PEI/pDNA復(fù)合物并不斷釋放，可作為抗原儲庫達(dá)到緩釋目的，且pDNA以復(fù)合物形式負(fù)載于水凝膠中時可進(jìn)一步延長其釋放時間。

Figure3 In vitr orelease curve of 20%PLGA-PEG-PLGA hydrogel(xˉ±s,n=3)A:Gel+pDNA group;B:Gel+PEI/pDNA group

3.5 PLGA-PEG-PLGA水凝膠體內(nèi)具有生物降解性

為了評價水凝膠的體內(nèi)可降解性，將20%PLGA-PEG-PLGA水凝膠200μL注射至小鼠皮下，于不同時間點觀察皮下水凝膠形態(tài)及體積變化。結(jié)果如圖4所示，將溶液態(tài)的水凝膠注射至體內(nèi)后可在注射部位形成凝膠，隨著時間延長，水凝膠在體內(nèi)逐漸降解，注射15 d后幾乎完全降解，這說明PLGA-PEG-PLGA水凝膠具有良好的生物可降解性。

3.6 PLGA-PEG-PLGA水凝膠可增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)

為了評估不同處理因素在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫水平，利用間接ELISA法檢測各組小鼠的血清特異性IgG抗體水平。結(jié)果顯示，與PBS組相比，Hydrogel組小鼠血清抗體水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而in vivo-jetPEI/pDNA組及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組血清特異性IgG抗體水平有升高表現(xiàn)（P＜0.05；P＜0.01），且Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組與in vivo-jetPEI/pDNA組比較亦有升高（P＜0.05），這表明DNA疫苗可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，DNA疫苗負(fù)載于水凝膠后可在一定程度上增強(qiáng)其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫水平。

Figure 5 Analysis of serum specific IgG antibody levels in immu?nized mice(xˉ±s,n=3)A:PBS;B:Hydrogel;C:in vivo-jetPEI/pDNA;D:Gel+in vivo-jetPEI/pDNA*P＜0.05,**P＜0.01 vs PBSgroup;#P＜0.05 vsin vivo-jetPEI/pDNA group

3.7 PLGA-PEG-PLGA水凝膠可增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖水平

利用CCK-8法檢測經(jīng)PA OprF蛋白刺激72 h后脾淋巴細(xì)胞增殖情況。圖6結(jié)果顯示，與PBS組相比較，Hydrogel組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（stimula?tion index，SI）無明顯差異（P＞0.05），而in vivojetPEI/pDNA組及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組脾淋巴細(xì)胞SI明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），且Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組SI較in vivo-jetPEI/pDNA組增高（P＜0.05），這說明脾淋巴細(xì)胞在體外受到同一抗原刺激后可再次增殖，水凝膠在一定程度上可增強(qiáng)銅綠假單胞菌OprF DNA疫苗誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平。

3.8 PLGA-PEG-PLGA水凝膠可增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平

收集各組小鼠脾淋巴細(xì)胞上清液，利用ELISA試劑盒檢測各組小鼠的細(xì)胞上清液分泌IFN-γ水平。結(jié)果如圖7所示，與PBS組比較，Hydrogel組脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），in vivo-jetPEI/pDNA及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平明顯增高（P＜0.01），Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組IFN-γ分泌水平較in vivo-jetPEI/pDNA組增高（P＜0.01），表明PA DNA疫苗可以誘導(dǎo)小鼠分泌IFN-γ，水凝膠的應(yīng)用可增強(qiáng)DNA疫苗誘導(dǎo)分泌的IFN-γ水平，這與脾淋巴細(xì)胞增殖實驗結(jié)果類似。

Figure 6 Proliferation analysis of splenic lymphocytes in immunized mice(xˉ±s,n=3)A:PBS;B:Hydrogel;C:in vivo-jetPEI/pDNA;D:Gel+in vivo-jetPEI/pDNA*P＜0.05,**P＜0.01 vs PBSgroup;#P＜0.05 vsin vivo-jetPEI/pDNA group

Figure 7 Analysis of IFN-γin supernatant of splenic lymphocytes in immunized mice(xˉ±s,n=3)A:PBS;B:Hydrogel;C:in vivo-jetPEI/pDNA;D:Gel+in vivo-jetPEI/pDNA**P＜0.01 vs PBSgroup;##P＜0.01 vsin vivo-jetPEI/pDNA group

4討論

銅綠假單胞菌感染是臨床治療的一大難題，由于銅綠假單胞菌對現(xiàn)目前大多數(shù)抗生素都存在耐藥性，并且多重耐藥菌株感染率正在逐年上升，因而研究PA疫苗可作為預(yù)防PA感染的一項有應(yīng)用前景的策略。PA疫苗經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已有不少候選抗原疫苗在各種動物感染模型證實其具有免疫效力并進(jìn)入臨床試驗階段［4］，但目前仍無真正應(yīng)用于臨床。OprF抗原基因高度保守，其在PA急性感染及慢性感染過程中均可表達(dá)［18］，臨床前試驗及臨床試驗均證實其具有免疫原性［7-8，19］，因而OprF是非常有應(yīng)用前景的一個候選抗原。本課題組前期實驗結(jié)果也證實pVAX1-OprF-VP22 DNA疫苗可引起小鼠體內(nèi)產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，對PA肺部感染模型具有保護(hù)作用［8］。但是DNA疫苗存在抗原提呈細(xì)胞攝取率低、易被體內(nèi)核酶降解而導(dǎo)致免疫原性不足的問題，因而需要新的遞送材料去改善這一不足。

溫敏水凝膠通常為自由流動的溶膠態(tài)，在低溫或室溫下具有良好的可注射性，被注入目標(biāo)部位后，因溫度變化載藥系統(tǒng)可以自發(fā)變成半固體凝膠，可以作為藥物的緩釋庫［20］。PLGA-PEGPLGA為物理交聯(lián)的PEG-PLGA三嵌段共聚物，是用于緩釋藥物載體、細(xì)胞和組織工程以及耳部疾病藥物輸送系統(tǒng)的最深入研究的溫敏水凝膠［21］，利用PLGA-PEG-PLGA作為DNA疫苗的遞送載體，在體內(nèi)注射部位形成凝膠持續(xù)釋放負(fù)載的質(zhì)粒DNA，作為抗原儲庫起到延長釋放、增加抗原提呈細(xì)胞對抗原攝取的作用。

通過倒置試管法發(fā)現(xiàn)，20%PLGA-PEG-PLGA水凝膠在4℃為自由流動的液體，而37℃表現(xiàn)為不能流動的凝膠，含或不含PEI/pDNA復(fù)合物的PLGA-PEG-PLGA水凝膠相變溫度均在32℃左右，且在37℃條件下均可在2 min內(nèi)形成凝膠，這說明加入PEI/pDNA復(fù)合物對水凝膠的相變溫度無明顯影響。動態(tài)光衍射法對水凝膠膠束粒徑檢測表明水凝膠自組裝形成的膠束直徑約44 nm，PDI為0.325，說明水凝膠內(nèi)部自組裝的膠束分布均一。這些結(jié)果表明水凝膠在小鼠體內(nèi)條件下可形成凝膠，具有作為抗原儲庫遞送DNA疫苗、延長釋放從而增強(qiáng)免疫效力的潛力。

材料的安全性是應(yīng)用于體內(nèi)的必要前提，利用CCK-8法檢測含或不含轉(zhuǎn)染試劑/pDNA復(fù)合物的水凝膠對DC 2.4細(xì)胞的細(xì)胞毒性大小，結(jié)果表明PLGA-PEG-PLGA水凝膠具有良好的細(xì)胞生物相容性，可用于進(jìn)一步體內(nèi)實驗。體外釋放實驗表明，在釋放7 d后大概80%的質(zhì)粒DNA從水凝膠中釋放出來，說明水凝膠可持續(xù)緩慢釋放所負(fù)載的質(zhì)粒DNA，延長質(zhì)粒DNA在體內(nèi)的留存時間。為了驗證水凝膠在體內(nèi)是否具有可生物降解性，將20%PLGA-PEG-PLGA水凝膠注射至小鼠皮下部位并觀察不同時間后皮下水凝膠凝膠殘留情況。結(jié)果表明，注射15 d后幾乎所有的水凝膠都被降解，這表明水凝膠具有生物可降解性，與之前文獻(xiàn)報道的結(jié)果相似［22］。PLGA-PEG-PLGA水凝膠以及其降解產(chǎn)物（乳酸、羥基乙酸和PEG）均被普遍認(rèn)為是安全的材料［23］，在整個實驗過程中小鼠精神、活動及進(jìn)食均正常，這表明PLGA-PEGPLGA水凝膠是可以應(yīng)用于體內(nèi)的安全材料。

為了驗證水凝膠可以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效力，將小鼠分為PBS組、Hydrogel組、in vivo-jetPEI/pDNA組以及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組，分別進(jìn)行免疫，然后收集各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞及血清進(jìn)行相關(guān)檢測。通過檢測免疫小鼠血清特異性IgG抗體和脾淋巴細(xì)胞分泌的特異性IFN-γ以評價各組制劑引發(fā)的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)水平，結(jié)果顯示，Hydrogel組的IgG抗體及IFN-γ水平與PBS組無差異，這表明空白水凝膠在體內(nèi)不會引發(fā)小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，水凝膠材料本身不具有特異性免疫原性。而in vivo-jetPEI/pDNA組及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組的IgG抗體及IFN-γ水平均增高，且Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組較in vivojetPEI/pDNA組增高更明顯，表明水凝膠可引起小鼠體內(nèi)產(chǎn)生更強(qiáng)的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)。

淋巴細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，其增殖情況是激活免疫反應(yīng)的一個關(guān)鍵事件。脾淋巴細(xì)胞增殖實驗可以評價抗原特異性脾細(xì)胞的免疫功能，間接反映機(jī)體的免疫水平［24］。研究中將各組免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞與OprF蛋白體外共孵育，測其刺激指數(shù)。與PBS組相比，Hydrogel組SI無明顯差異，而in vivo-jetPEI/pDNA及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組SI明顯增高，且Gel+in vivo-jetPEI/pDNA組較in vivo-jetPEI/pDNA組更高（圖6）。這表明免疫后小鼠分離的脾淋巴細(xì)胞在體外受到同一抗原的再次刺激時可再次增殖，這可能與脾淋巴細(xì)胞獲得免疫記憶有關(guān)［25］，水凝膠可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生更高水平的免疫記憶。

分析水凝膠遞送系統(tǒng)增強(qiáng)了DNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)的原因，可能是水凝膠溶液在注射部位形成凝膠后，可持續(xù)地釋放所負(fù)載的質(zhì)粒DNA，使注射部位細(xì)胞周圍的質(zhì)粒DNA濃度保持在較高水平［26］；此外聚合物降解形成的PLGA-PEG-PLGA膠束與pDNA/陽離子聚合物的共存亦促進(jìn)細(xì)胞對質(zhì)粒DNA的內(nèi)吞作用［17，25］，這兩方面的因素共同促進(jìn)了細(xì)胞對質(zhì)粒DNA的攝取，增強(qiáng)了質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率，從而引發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

綜上，本實驗制備了載PA DNA疫苗的PLGAPEG-PLGA溫敏水凝膠遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)易于制備，具有安全可降解的生物特性，可作為抗原儲庫持續(xù)釋放抗原，增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞對抗原的攝取，進(jìn)而誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，最終達(dá)到增強(qiáng)PA DNA疫苗的免疫效力的作用。目前尚無PA DNA疫苗溫敏水凝膠遞送系統(tǒng)的報道，本研究的載PA DNA疫苗PLGA-PEG-PLGA溫敏水凝膠系統(tǒng)是研發(fā)PA DNA疫苗的一種有前景的應(yīng)用平臺。