張 藝，杭太俊，宋 敏

（中國藥科大學藥物分析系，南京210009）

脂質體是指將藥物包封于脂質雙分子層中形成的具有納米結構的新型制劑。包裹藥物的脂質雙分子層由磷脂和膽固醇組成，其結構內核由磷脂分子的頭部聚集而成，具有親水性，可包裹水溶性藥物［1］，如已上市的鹽酸多柔比星脂質體注射液，其較傳統(tǒng)劑型靶向性有所增強，不良反應明顯降低［2］。磷脂分子的尾部平行排列組成親脂性的圓環(huán)結構，可攜帶脂溶性藥物。例如，目前已上市的注射用紫杉醇脂質體，它是將脂溶性藥物紫杉醇包裹在脂質體中，藥物溶解性得以增加，同時避免了聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇混合溶媒的使用，極大地減輕了溶媒所引起的過敏反應［3］。

包封率是脂質體的關鍵質量屬性，它指的是包封在脂質雙分子層中的藥物含量占總投藥量的百分比，能反映出脂質體中藥物包封程度的高低，以指導制備工藝的改進。

由于包封的藥物性質不同，脂質體膜材料不同，測定每種脂質體包封率的最佳方法往往需要經實驗考察才能確定。包封率測定的關鍵是將包封藥物和未包封的游離藥物分離，再利用光譜、色譜等分析手段檢測包封藥物或游離藥物的濃度。

常用的包封率測定方法有：離心法、超濾離心法、葡聚糖凝膠柱法、微柱離心法、透析與反透析法、魚精蛋白凝聚法等［4］。

1 常用的包封率測定方法

1.1 離心法

按照離心轉速的不同，離心法分為低速離心法和超速離心法。低速離心法適用于脂溶性藥物［4］，其工作原理是脂溶性的游離藥物不溶于溶解脂質體所需的水相介質，而懸浮在體系中，采用相對較小的離心強度和較短的離心時間，這些未溶的游離藥物會因離心力的作用而沉降，但脂質體仍存在于上清液中，從而實現(xiàn)分離。

Sun［5］合成了乙酰半胱氨酸衍生物XXH-32，其難溶于水，傳統(tǒng)劑型給藥后生物利用度低，于是將其制成脂質體。在測定XXH-32脂質體的包封率時考察了1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 r/min 5種離心轉速，2 000 r/min時分離度最大，故最終選擇了2 000 r/min為離心轉速；還考察了2、4、6、8和10 min 5種離心時間，發(fā)現(xiàn)離心6～10 min，分離效果差別不大，所以選擇離心6 min。實際應用中，上清和沉淀常常不易完全分離，故低速離心法適用范圍相對有限。

超速離心法要求離心轉速大于20 000 r/min，離心時間一般要長于30 min。離心過程中因空氣摩擦產熱，需使用控溫離心機。與低速離心法剛好相反，超速離心法中脂質體最終存在于沉淀中。由于脂質體和不溶的游離藥物會一起沉降下來，無法實現(xiàn)二者的分離，所以此法適用于水溶性較好的藥物的測定，可保證游離藥物仍存在于上清液中。此外應注意較強的離心力作用可能會導致微粒聚集，破壞脂質體雙分子層結構，導致藥物發(fā)生泄漏［4］。Lopez-Pinto等［6］發(fā)現(xiàn)在制備脂質體時可以通過增加膽固醇的用量來提高脂質雙分子層的硬度，以減小離心力對脂質體結構的影響。Wang等［7］采用超速離心法測定了鹽酸多柔比星脂質體的包封率：取鹽酸多柔比星脂質體1 mL，以200 000 r/min轉速離心30 min，收集上清液并用生理鹽水定容至5 mL，測定其中游離藥物質量，再根據(jù)含藥總量計算出包封率。Han等［8］發(fā)現(xiàn)脂質顆粒與檸檬酸鈉能夠形成絮狀物，離心后此種絮狀物會上浮，而游離藥物仍存在于溶液中，利用此性質可將脂質體和游離藥物分離。此外，還考察了加入的檸檬酸鈉濃度，發(fā)現(xiàn)加入濃度越高，溶液密度越大，脂質顆粒上浮的越多，和游離藥物分離就越完全。對于紫杉醇陽離子脂質納米粒，加入10%的檸檬酸鈉分離最優(yōu)；而對于多柔比星脂質體，加入20%的檸檬酸鈉分離最優(yōu)。

Xu［9］綜合了兩種離心方法，即先進行低速離心，再超速離心，更為準確地測定了有機金屬銥配合物脂質體包封率的數(shù)值。先將有機金屬銥配合物脂質體混懸液在4℃條件下以5 000 r/min的轉速離心10 min，未包封的金屬銥配合物被沉淀下來，再將上清液用35 000 r/min的轉速離心1 h，以去除上清液中的脂質體部分，再分別測定低速離心后沉淀中和超速離心后上清液中的藥物含量，二者總和為脂質體中游離藥物的含量。

1.2 超濾離心法

超濾離心法是將脂質體放入配有超濾膜的超濾管中，在適宜的轉速下離心，游離藥物在離心力的作用下可通過超濾膜，而脂質體則被截留，從而實現(xiàn)二者的分離。

超濾離心法多用于測定水溶性藥物脂質體的包封率。而Sui等［10］利用該法成功測定了脂溶性藥物甘草次酸脂質體的包封率：取甘草次酸脂質體溶液0.5 mL，以10 000 r/min的轉速超濾離心30 min，再檢測超濾液中游離甘草次酸的濃度并計算包封率。還分別進行了游離藥物回收率以及游離藥物和空白脂質體混合物的加樣回收率試驗，甘草次酸的回收率均在97%以上，說明游離的甘草次酸可以完全通過超濾膜。Mu等［11］制備了吡唑類活性物質XY-4陽離子脂質體，并探究了不同超濾時間和離心轉速對包封率測定的影響，最終確定超濾條件為4 000 r/min離心10 min。Gao等［12］制備了長循環(huán)嗎啡脂質體，采用超濾離心法測定其包封率，離心條件為以10 319 r/min的轉速離心5 min，不更換超濾單元，重復超濾離心3次，取最后一次超濾液稀釋后進樣，測定其中游離嗎啡濃度，并計算包封率。

然而“濃差極化”現(xiàn)象的存在限制了超濾法的應用。濃差極化現(xiàn)象是由于在超濾過程中，溶劑和小分子溶質能透過超濾膜，而大分子溶質被截留在膜內，這就會導致超濾膜表面的大分子溶質濃度升高，引起膜附近的滲透壓增加，阻礙溶液繼續(xù)向超濾膜方向擴散，進而降低了溶劑和小分子物質的膜透過率。兩性霉素B是一種常用的抗真菌藥，已有多家藥企研制出兩性霉素B脂質體并成功上市。Ran等［13］制備了兩性霉素B脂質體，超濾離心后，將獲得的超濾液進行HPLC分析，結果未測到兩性霉素B。Ran等認為脂溶性較強的兩性霉素B在水中形成的大分子聚合物，脂質雙分子層和其他有黏性的輔料都可能導致了濃差極化層的形成，從而降低了膜的滲透性，使得游離小分子藥物的透過率減小。對樣品進行稀釋，從而減小磷脂類輔料的黏度可在一定程度上減輕濃差極化現(xiàn)象，但是對于包載脂溶性藥物的脂質體，稀釋不但會降低游離藥物濃度，還可能導致“滲透壓休克”［14］，即因脂質體膜內外滲透壓不一致而導致脂質體泄漏。若稀釋后發(fā)生了滲透壓休克，還可以嘗試通過增大離心力來增加游離藥物的膜透過率。但傳統(tǒng)的超濾膜在高離心力作用下容易發(fā)生破損，而中空纖維超濾離心裝置憑借其中空結構可以耐受更高的離心力，并且由于中空纖維膜一直浸沒在樣品溶液和超濾液之間，游離藥物可以自由通過超濾膜，因此能夠較好地避免濃差極化現(xiàn)象［15］。Xu等［16］利用中空纖維超濾離心法測定了注射用兩性霉素B脂質體的包封率，高、中、低三個水平的兩性霉素B對照溶液經過中空纖維超濾離心之后，回收率約為98%，空白脂質體加樣回收率為100%左右，可見中空纖維超濾離心法更適用于兩性霉素B脂質體包封率的測定。

1.3 葡聚糖凝膠柱法

葡聚糖顆粒在溶脹后可形成凝膠狀結構，其內部具有一定大小的孔徑，小分子游離藥物可進入孔內，實現(xiàn)一定程度的保留；而脂質體粒徑大于凝膠孔徑，脂質體無法進入孔內，于是少量洗脫液便可將其洗脫下來。利用脂質體和游離藥物在葡聚糖凝膠柱上保留能力的不同可實現(xiàn)二者的分離。Li等［17］制備了轉鐵蛋白修飾的長春新堿-粉防己堿脂質體，采用葡聚糖G-50凝膠柱測定其包封率。由于該批脂質體包封率較高，導致含量較低的游離藥物在洗脫曲線上未出現(xiàn)明顯的洗脫峰，于是決定向脂質體中加入一定量的長春新堿對照品，以增加游離藥物含量，使洗脫情況能夠更清晰地呈現(xiàn)出來。Li等在0.5 mL脂質體中加入了0.2 mg長春新堿對照品，混勻后加于凝膠柱上，以PBS緩沖液進行洗脫，收集20管洗脫液，測定其中長春新堿的含量并繪制洗脫曲線，從洗脫曲線上可以看出脂質體和游離長春新堿完全分離。由于Sephadex G-50在遇到有機溶劑時易發(fā)生脫水，因此Zheng等［18］采用更耐受有機溶劑的Sephadex LH-20凝膠柱分離阿霉素與他莫昔芬雙載藥脂質體和游離藥物，洗脫液選用了脂質體的外水相HEPES緩沖液以及甲醇。Xu等［19］比較了葡聚糖凝膠柱法和中空纖維超濾離心法測定吲哚美辛與維生素A共載脂質體的包封率，發(fā)現(xiàn)葡聚糖凝膠柱法測定的包封率值要低于中空纖維超濾離心法；分析原因為葡聚糖凝膠柱法中加入的大量洗脫液稀釋了整個脂質體系統(tǒng)，破壞了脂質體和游離藥物原有的動態(tài)平衡，脂質體發(fā)生了泄漏，因而測得的包封率值較低。故在使用此法時，一定要密切關注脂質體結構的完整性。若實驗效果不佳，可用微柱離心法替代。

1.4 微柱離心法

相比葡聚糖凝膠柱法，微柱離心法加入的洗脫液體積大大減小，避免了脂質體因稀釋作用而發(fā)生的泄漏。此法是將溶脹好的葡聚糖凝膠或經預處理的離子交換樹脂裝入注射器中，反復平衡、離心后制成干燥的微柱，然后在其頂端加入脂質體混懸液，靜置幾分鐘后再加入洗脫液，設置適宜的離心轉速將脂質體洗脫下來［20］。若凝膠對脂質體有很強的吸附作用，則不能選用該法。實驗中應注意離心轉速的選擇，轉速過大或過小都可能引起凝膠柱柱頭斷裂，且轉速過大會將游離藥物也洗脫下來。Song等［21］制備了表面修飾唾液酸的唑來膦酸與多柔比星共載脂質體，采用陽離子交換纖維微柱法測定其包封率，離心條件為以2 000 r/min的轉速離心4 min，再用重蒸水洗脫2次，測定洗脫液中包封藥物濃度，并計算包封率。Xu等［22］對預飽和Sephadex G-25微柱所需的空白脂質體用量及預飽和次數(shù)進行了考察，發(fā)現(xiàn)當預飽和空白脂質體用量為150μL時過柱率已達到100%，說明此時微柱對空白脂質體的吸附已飽和，所以最終預飽和用量選定為150μL；預飽和3次時，空白脂質體的過柱率最接近100%，故確定預飽和次數(shù)為3次。因此當脂質體濃度較低時應注意對預飽和條件進行考察，以減少柱分析過程中脂質體的損失。

1.5 透析與反透析法

透析法是將脂質體放入截留一定分子量的透析袋內，一般用水或PBS緩沖液作為透析介質，游離藥物因透析袋內外的濃度差而向透析介質中轉移，而脂質體因為粒徑較大則被截留在透析袋內，二者因此實現(xiàn)分離。但脂溶性游離藥物在透析介質中溶解度較差，會聚集在透析膜表面，堵塞膜上微孔而無法進入透析外液。

Mura等［23］為增加脂溶性藥物苯佐卡因在透析介質中的溶解度，將50%乙醇作為透析介質。Feng［24］將黃芩苷對照品溶液1 mL置于透析袋內，再放在PBS緩沖液250 mL中進行透析，在0～13 h范圍內，每小時取透析液3 mL測定其中藥物含量，并繪制透析曲線，發(fā)現(xiàn)7 h時已透析完全，于是將透析時間設定為7 h。隨后進行的回收率試驗中，高、中、低3個濃度的回收率均在97%以上，說明此法可用于黃芩苷脂質體包封率的測定。

透析試驗中為了滿足漏槽條件，需要大量的透析介質，這無疑會稀釋整個脂質體系統(tǒng)，破壞脂質體和周圍游離藥物的動態(tài)平衡，甚至導致脂質體的泄漏，并且較長的透析時間也對脂質體的穩(wěn)定性有很高的要求。反透析法可以避免上述問題的發(fā)生。它是將脂質體放在透析袋外，透析袋內裝入透析介質。由于透析介質用量大大減少，可有效避免脂質體因為稀釋作用而發(fā)生的泄漏。Wang等［25］制備了β-紫羅蘭酮脂質體，在測定包封率時取20%乙醇5 mL置于透析袋內，再將脂質體混懸液5 mL用20%乙醇水溶液稀釋至200 mL，把透析袋放入其中進行透析，12 h后測定透析液中游離β-紫羅蘭酮的濃度。Bai［26］比較了透析法和反透析法對馬來酸桂哌齊特脂質體包封率的測定效果，發(fā)現(xiàn)透析法中游離藥物一直難以達到透析平衡，而反透析法中透析150 min后基本達到透析平衡，決定選用反透析法測定包封率。

1.6 其他方法

包封率測定方法還包括：魚精蛋白凝聚法、固相萃取法、熒光法等。

魚精蛋白是一種堿性蛋白質，帶正電，它可與帶負電或中性的脂質體結合形成聚合物，密度有所增加，離心后脂質體-魚精蛋白聚合物被沉淀下來，因而與游離藥物實現(xiàn)分離。Fu等［27］將黃藤素納米柔性脂質體1.5 mL與魚精蛋白溶液（10 mg/mL）1.5 mL混合，搖勻后靜置3 min，再進行離心，之后將沉淀用曲拉通X-100甲醇溶液2 mL處理后進樣測定。可以觀察到經過魚精蛋白沉淀后，原來均一的脂質體混懸液分層明顯，上層藥液澄清透亮，下層沉淀緊密，便于后續(xù)分離操作。Liu等［28］自制了多西他賽脂質體，并比較了高速離心法和魚精蛋白凝聚法測定結果的差異，同時考察了加入不同濃度的增溶劑吐溫80對包封率測定結果的影響；從實驗結果可以看出高速離心法測定的結果要低于魚精蛋白凝聚法；此外隨著吐溫80濃度增加，兩種方法測定的包封率結果均減小。Liu等認為高速離心作用和表面活性劑吐溫80，均可能會破壞脂質體原有的亞微米級結構，導致包封率測定值偏低。而魚精蛋白凝聚法利用的是脂質體的電荷性質，不會對其結構產生影響。

固相萃取法利用的是色譜吸附原理，游離藥物被吸附在極性相近的SPE柱固定相上，而脂質體在SPE柱上無保留，少量水便可洗脫下來。Deshpande等［29］利用Oasis HLB固相萃取小柱成功分離了血漿中的兩性霉素B脂質體和游離藥物，其在待分離血漿混合物中加入了0.1%氨水溶液500μL，作用是增強游離藥物在固定相上的保留。但是游離藥物在高濃度點的回收率不理想，懷疑是氨水溶液加入量不足，于是在收集到的洗脫液中再加入0.1%氨水溶液250μL，再將這部分洗脫液重新上樣，游離的兩性霉素B被SPE柱固定相充分吸附，獲得了滿意的回收率結果。Zhang等［30］發(fā)現(xiàn)市售的C18固相萃取小柱常常會吸附紫杉醇脂質體，導致包封率測定結果偏低，而且由于市售固相萃取小柱中的填料孔徑小而致密，大粒徑的脂質體很難被洗脫下來，于是自制了一種固相萃取柱。為了減弱填料對脂質體的吸附，Zhang等使用了較大粒徑的填料（40～60μm），并且減小了裝填的緊密程度，此外還對固相萃取柱下端篩板進行了鈍化處理，最終獲得了滿意的結果。固相萃取法對脂質體和游離藥物的分離度較高，因為它是借助更特征的，更穩(wěn)定的吸附能力的差異實現(xiàn)分離。然而該法較為復雜，藥物與SPE柱固定相之間吸附作用的強弱受多種因素影響，需要進行大量實驗才能摸索出最佳的實驗條件。

目前使用的包封率測定方法大部分都需要先將脂質體和游離藥物分離，而熒光法不需進行分離，只要利用包封藥物和游離藥物不同的熒光特性，比較脂質體破乳前后熒光強度的變化，便可計算出包封率。Meng等［31］將RiboGreen熒光染料加入到共載米鉑與核酸miR-34a陽離子脂質體溶液中，游離的miR-34a分子會與RiboGreen染料結合產生熒光，利用外標法可以計算出游離miR-34a的濃度，另取一份脂質體破乳后測定miR-34a總濃度，從而計算出包封率。熒光法專屬性強，靈敏度高，但能發(fā)生特定熒光反應的化合物較少，限制了熒光法在包封率測定中的應用。

上述脂質體包封率測定案例根據(jù)主藥溶解性和磷脂類輔料組成的不同總結見表1。

表1 幾種載藥脂質體包封率測定方法對比

2結 論

本文介紹了多種常見的包封率檢測方法，如低速離心法適用于脂溶性藥物，操作簡單，且不易破壞脂質體膜結構，但脂質體和游離藥物常常不能完全分離；超速離心法多用于水溶性藥物，且要求脂質體膜結構有一定的硬度，能夠耐受高轉速的影響。超濾離心法適用范圍較廣，超濾膜的材料和截留分子量有多種類型，可滿足試驗者的多重需要；其缺點是可能會出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象，在一定程度上稀釋脂質體待測溶液可以避免該現(xiàn)象的發(fā)生。葡聚糖凝膠柱法和微柱離心法均是利用分子排阻的原理來分離，但如果藥物在凝膠柱上無保留或吸附過強，則不能采用這兩種方法。葡聚糖凝膠柱法由于大量洗脫液的加入稀釋了脂質體系統(tǒng)，可能會導致脂質體泄漏。但是微柱離心法的柱體積小，加入洗脫液的體積也少，不會引起脂質體泄漏，但是需要考察離心轉速，以獲得最佳的分離效果。透析法也是測定包封率的常用手段，適用于水溶性藥物，但是透析時間一般長達36 h以上，對脂質體穩(wěn)定性有較高要求；此外大量透析介質的加入同樣會稀釋脂質體系統(tǒng)，也可能導致脂質體泄漏。反透析法極大地減少了透析介質的用量，較好地避免了因稀釋作用而發(fā)生的脂質體泄漏。魚精蛋白凝聚法只適用于帶負電及中性的脂質體，而固相萃取法雖然在分離脂質體和游離藥物方面有不錯的效果，但是實驗方法復雜，不易摸索出最佳分離條件。熒光法可在脂質體和游離藥物共存的狀態(tài)下測定包封率，不要求把二者分離，但一般均需要引入熒光指示劑，發(fā)生某種熒光反應來計算包封率。

根據(jù)待測物的性質和各種測定方法的特點，總結出脂質體包封率測定方法選擇決策樹，見圖1。

3展望

現(xiàn)有的包封率測定方法基本上都是利用脂質體和游離藥物在粒徑尺寸方面的差異先將二者分離，再準確測定某一方的濃度。但是這種物理差異專屬性不強且不穩(wěn)定，易受影響和干擾。魚精蛋白凝聚法借助電荷吸附作用增大了脂質體和游離藥物的物理差異，使二者分離得更完全；SPE法和離子交換色譜法利用脂質體和游離藥物在色譜固定相上保留能力的差異實現(xiàn)了分離，也是一種較好的選擇；熒光法不需要分離脂質體和游離藥物，通過比較破乳前后熒光強度的變化便可計算出包封率。

圖1 脂質體包封率測定方法選擇決策樹

未來包封率測定方法應該更多地結合光譜、色譜等手段，以增加方法的專屬性和可靠性，還可利用脂質體和游離藥物在物理、化學性質方面其他的不同點，開發(fā)出具有不同工作原理的新方法，并且各種方法之間可以相互印證，使測定結果更可靠。