魏大廈，管 昕，張盛濱，余 芳，王存芳，周 余，龐 濤*

（1中國藥科大學藥物科學研究院新藥篩選中心，南京210009；2廣東隆賦藥業(yè)股份有限公司，中山528451）

神經(jīng)元和神經(jīng)元之間的軸突連接對于維持神經(jīng)系統(tǒng)的功能十分重要，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，多發(fā)性硬化［1］、腦卒中［2］、肌萎縮性側(cè)索硬化癥［3］和帕金森病［4］等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進程中均出現(xiàn)神經(jīng)元軸突損傷，破壞神經(jīng)元的功能。神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏、膠質(zhì)疤痕的形成以及微環(huán)境中具有抑制作用的分子都會導(dǎo)致軸突再生障礙［5］，但當藥物可以促進軸突再生時即可恢復(fù)神經(jīng)元功能，改善損傷后的中樞神經(jīng)元［6］。因此，尋找促進軸突再生的藥物可以成為治療損傷神經(jīng)元的新策略。

注射用腦蛋白水解物（Ⅱ）［cerebroprotein hydrolysate for injection（Ⅱ），CBL］是豬腦蛋白經(jīng)酶水解而產(chǎn)生的富含多種氨基酸和小分子生物活性多肽的混合物，作用于神經(jīng)系統(tǒng)，促進神經(jīng)元的存活，具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護的作用［7］。Plosker等［8］研究發(fā)現(xiàn)，對SD大鼠靜脈注射125I標記的腦蛋白水解物0.79 mg，35 min后，檢測到每克腦組織中腦蛋白水解物的平均含量為170～237 ng。據(jù)文獻報道［9-10］，已在臨床上使用CBL治療缺血性腦血管病，可顯著改善神經(jīng)功能，促進神經(jīng)元的分化，保護神經(jīng)元免受缺血和神經(jīng)毒素的影響。但是，尚不清楚CBL改善神經(jīng)功能的作用是否與軸突再生有關(guān)，缺乏對CBL的作用機制的探究。

本文研究了CBL對神經(jīng)細胞軸突再生的作用，闡述了CBL的作用機制，發(fā)現(xiàn)CBL可能是通過激活TrkB信號通路發(fā)揮作用，研究結(jié)果為進一步提高CBL藥物臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1材料

1.1 藥品與試劑

注射用腦蛋白水解物（Ⅱ）（CBL，國藥準字H20051230，規(guī)格：30.5 mg，無菌凍干粉，內(nèi)含約16種游離氨基酸和不同長度的多肽，以及適宜輔料，廣東隆賦藥業(yè)股份有限公司）；MEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素（美國Gibco公司）；Neurobasal培養(yǎng)基、B27添加劑、胰酶、Hoechst 33342（美國Invitrogen公司）；DNA酶、多聚賴氨酸（美國Sigma公司）；胎牛血清（美國Clark公司）；Hank's平衡鹽緩沖溶液（美國賽默飛世爾公司）；RIPA細胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）；牛血清白蛋白（BSA，南京生興生物科技有限公司）；上樣緩沖液（美國Bio-Rad公司）；Alexa Fluor 633羊抗鼠IgG（H+L）抗體、p-TrkB（Tyr706）抗體（美國Affinity Biosciences公司）；β-actin抗體（武漢愛博泰克公司）；TUBB3抗體、TrkB抗體（美國Protein?tech公司）；山羊血清（北京索萊寶公司）；Triton-100（上海生工生物工程有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

FV3000型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；Operetta Phenix高內(nèi)涵熒光成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）；BT25S電子分析天平（德國Sar?torius公司）；BB15型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；垂直凝膠電泳儀、Gel DOCXR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；冷凍離心機（美國Thermo公司）。

1.3 細胞株和動物

Neuro-2a細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。懷孕兩周的SPF級C57BL/6孕鼠，體重（30±2）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司（合格證號：SYXK（蘇）2016-0011）。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2方法

2.1 化合物的配制

如先前報道所述［11-12］，CBL的蛋白質(zhì)含量根據(jù)凱氏定氮法（GB 50010.3—2011）測定。從-20℃冰箱中取出CBL粉末30 mg，加入無菌生理鹽水6 mL，然后配成5 mg/mL的CBL生理鹽水溶液，放在-20℃冰箱保存。

2.2 小鼠原代皮層神經(jīng)細胞的培養(yǎng)

根據(jù)文獻報道［13］，將懷孕14 d的C57BL/6孕鼠用異氟烷麻醉，75%乙醇溶液噴灑于表皮，在超凈臺內(nèi)取出胎鼠立即放入預(yù)冷的Hank's平衡鹽緩沖溶液中，在顯微鏡下分離出大腦皮質(zhì)，除去血管和腦膜，加入等體積的0.25%胰酶室溫消化30 min，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清液，加入含10%FBS的DMEM/F12重懸均勻，70μm孔徑的細胞篩網(wǎng)過濾，制備單細胞懸液，以每孔4×105個細胞接種到多聚賴氨酸包被的24孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2的細胞孵箱中培養(yǎng)。4 h后棄去培養(yǎng)基，換用含2%B27添加劑的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔3天對小鼠原代神經(jīng)細胞進行半量換液。

2.3 Neuro-2a細胞的培養(yǎng)

將Neuro-2a細胞用含10%FBS的MEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細胞孵箱中培養(yǎng)，每隔24小時換液。當細胞達到80%～90%融合度后用0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液備用。

2.4 蛋白免疫印跡分析

對細胞進行相應(yīng)的處理后，棄掉細胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌3次，加入含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管，用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，加入適量的上樣緩沖液后，在95℃的金屬浴中加熱10 min，使蛋白變性。每個泳道加入同等質(zhì)量的蛋白進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，隨后用5%BSA溶液封閉60 min；加入5%BSA溶液稀釋的一抗溶液（p-TrkB、TrkB、β-actin），4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌5次后用HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。隨后用ECL化學發(fā)光液孵育2 min，使用凝膠成像系統(tǒng)分析。用Image J軟件分析圖像灰度，以目的蛋白和其內(nèi)參蛋白β-actin的光密度值做比值，作為目的蛋白的相對表達量，實驗重復(fù)3次。

2.5 細胞免疫熒光實驗

將Neuro-2a細胞、小鼠原代神經(jīng)細胞接種于共聚焦小皿中，在37℃、5%CO2的細胞孵箱培養(yǎng)24 h，加入不同質(zhì)量濃度（1μg/mL、5μg/mL）的CBL生理鹽水溶液，對照孔加入相應(yīng)體積的生理鹽水，分別于24 h、48 h及72 h棄去小皿中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌3次；加入4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌3次；加入5%山羊血清溶液，室溫孵育1 h；棄掉5%山羊血清溶液后，加入5%山羊血清稀釋后的TUBB3一抗，4℃孵育12 h；用PBS溶液洗滌3次，然后用5%山羊血清稀釋后的羊抗鼠IgG二抗溶液，室溫避光孵育1 h；最后加入Hoechst 33342染液，采用激光掃描共聚焦顯微觀察并拍照保存，采用Image J軟件對圖像進行分析。

2.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均采用xˉ±s表示。單因素多組別之間用One-Way ANOVA加Bonferroni檢驗進行分析差異，多因素多組別之間用Two-Way ANOVA加Bonferroni檢驗進行分析差異。當組間差異P＜0.05，即認為組間差異具有統(tǒng)計學意義。

3結(jié) 果

3.1 CBL對低血清誘導(dǎo)Neuro-2a細胞軸突再生模型的作用

將Neuro-2a細胞接種在培養(yǎng)皿中，根據(jù)文獻報道［14］，用含有0.1%FBS的MEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)其軸突再生；然后將1μg/mL和5μg/mL的CBL分別作用于Neuro-2a細胞24、48及72 h，對其進行免疫熒光實驗。結(jié)果如圖1所示，與溶劑對照組相比，1μg/mL和5μg/mL的CBL處理后的Neuro-2a細胞中，軸突長度以及有軸突細胞的數(shù)目顯著增加，且CBL質(zhì)量濃度為5μg/mL，作用時間為72 h時，CBL促進Neuro-2a細胞軸突再生的作用最為明顯。

3.2 CBL對小鼠原代皮層神經(jīng)細胞軸突再生的作用

為了探索CBL對小鼠原代神經(jīng)細胞軸突再生的作用，將不同濃度的CBL分別處理小鼠原代皮層神經(jīng)細胞，通過免疫熒光染色檢測小鼠原代皮層神經(jīng)細胞中軸突長度及有軸突細胞的比例。結(jié)果如圖2所示，與溶劑對照組相比，1μg/mL、5μg/mL的CBL作用于小鼠原代皮層神經(jīng)細胞24 h、48 h及72 h后，小鼠原代皮層神經(jīng)細胞的軸突長度以及有軸突細胞的數(shù)目顯著增加（P＜0.001），并且當CBL質(zhì)量濃度為5μg/mL處理原代皮層神經(jīng)元72 h時，CBL促進原代皮層神經(jīng)元軸突再生作用最強。

3.3 CBL對Neuro-2a細胞TrkB磷酸化水平的作用

為了研究CBL對Neuro-2a細胞軸突再生的作用機制，給予Neuro-2a細胞5μg/mL的CBL分別處理15 min、30 min及1，3，6，9，12 h，通過Western blot檢測CBL對Neuro-2a細胞TrkB磷酸化水平的影響。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，CBL作用0.5、1及3 h后能顯著上調(diào)Neuro-2a細胞的TrkB磷酸化水平。當CBL作用于Neuro-2a細胞1 h時，TrkB的磷酸化水平達到最高值，且與對照組有顯著性差異（P＜0.001）。

Figure 1 Effect of cerebroprotein hydrolysatefor injection(II)(CBL)on axon regeneration of Neuro-2a cells incubated with low serumA:Representative immunofluorescence staining for the TUBB3(red)in Neuro-2a cells treated with different concentrations of CBL for 24 h,48 h and 72 h after low serum culture,scale bar=100μm;B:Axon length of Neuro-2a cells was measured by Image J software;C:Percentage of the axon of cellswascounted by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group

Figure2 Effect of CBLon axon regeneration of mouseprimary cortical neuronal cellsA:Representative immunofluorescence staining for the TUBB3(red)and Hoechst(blue)in mouse primary cortical neuronal cells treated with different concentrations of CBL for 24 h,48 h and 72 h,scale bar=100μm;B:Axon length of mouse primary cortical neuronal cells was measured by Image J software;C:Percentage of the axon of cells was counted by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group

Figure3 Effect of CBL on the phosphorylation of TrkBat different time points in Neuro-2a cellsA:Neuro-2a cells were treated with CBL(5μg/mL)at the different timepoints,and theexpression of p-TrkBand total TrkBweredetected by Western blot;B:Quantitativemeasurement of theratio of p-TrkB/TrkBexpression by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)***P＜0.001 vs control group

為了研究CBL質(zhì)量濃度與Neuro-2a細胞p-TrkB表達水平是否存在相關(guān)性，用0.2、1、5μg/mL的CBL溶液處理Neuro-2a細胞1 h，通過Western blot檢測不同質(zhì)量濃度的CBL對Neuro-2a細胞內(nèi)TrkB磷酸化水平的影響。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，5μg/mL的CBL處理后的Neuro-2a細胞中TrkB磷酸化水平顯著升高。

上述結(jié)果表明，當CBL質(zhì)量濃度為5μg/mL、作用于Neuro-2a細胞1 h時，Neuro-2a細胞的TrkB磷酸化水平最高。

Figure4 Effect of CBL on the phosphorylation of TrkBin different concentrations in Neuro-2a cellsA:Neuro-2a cells were treated with different concentrations of CBL for 1 h,and the expression of p-TrkB and total TrkB were detected by Western blot;B:Quantitativemeasurement of theratio of p-TrkB/TrkBexpression by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)***P＜0.001 vs control group

3.4 CBL對小鼠原代皮層神經(jīng)細胞TrkB磷酸化水平的作用

為了確定CBL對小鼠原代皮層神經(jīng)細胞是否也存在這樣的機制，用5μg/mL的CBL處理小鼠原代皮層神經(jīng)細胞15 min、30 min、1 h、3 h及6 h，通過Western blot檢測小鼠原代皮層神經(jīng)細胞中TrkB磷酸化水平的變化。結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，5μg/mL的CBL處理后，小鼠原代皮層神經(jīng)細胞中TrkB的磷酸化水平顯著升高。當CBL作用于小鼠原代皮層神經(jīng)細胞1 h時，細胞內(nèi)TrkB的磷酸化水平達到最高值，且與對照組有顯著性差異（P＜0.001）。

為了研究CBL質(zhì)量濃度與小鼠原代皮層神經(jīng)細胞TrkB磷酸化水平是否存在相關(guān)性，用不同濃度的CBL溶液處理小鼠原代皮層神經(jīng)細胞1 h，用Western blot檢測小鼠原代皮層神經(jīng)細胞中TrkB的磷酸化水平。結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，0.2、1或5μg/mL的CBL溶液處理過的小鼠原代皮層神經(jīng)細胞中TrkB磷酸化水平顯著升高，并且當CBL質(zhì)量濃度為5μg/mL時小鼠原代皮層神經(jīng)細胞中TrkB磷酸化水平最高。

上述結(jié)果表明，當CBL質(zhì)量濃度為5μg/mL，作用于小鼠原代皮層神經(jīng)細胞1 h時，CBL能夠顯著上調(diào)細胞內(nèi)TrkB的磷酸化水平，可能通過激活TrkB信號通路促進神經(jīng)元軸突再生。

Figure 5 Effect of CBL on the phosphorylation of TrkBat different timepoints in mouseprimary cortical neuronal cellsA:Mouse primary cortical neuronal cells were treated with CBL(5μg/mL)at the different time points,and the expression of p-TrkB and total TrkB weredetected by Western blot;B:Quantitativemeasurement of theratioof p-TrkB/TrkBexpression by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)***P＜0.001 vs control group

4討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，通過軸突再生促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)，但由于自身再生能力差，以及微環(huán)境中的抑制因子，導(dǎo)致軸突再生失敗，無法修復(fù)損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。有研究表明，腦蛋白水解物可以促進突觸的再生［15］，但不清楚CBL促進神經(jīng)細胞軸突再生的作用及其分子機制。在本研究中，證明了CBL可以促進神經(jīng)細胞軸突再生，可以上調(diào)神經(jīng)細胞TrkB的磷酸化水平；當CBL作用于神經(jīng)細胞1 h時，TrkB的磷酸化水平達到峰值，并且隨著CBL濃度的增加，TrkB的磷酸化水平也隨之增加，當CBL質(zhì)量濃度為5μg/mL時可以顯著促進神經(jīng)細胞軸突再生。因此，上調(diào)TrkB的磷酸化水平可能是CBL促進神經(jīng)細胞軸突再生的重要分子機制，CBL可能通過激活TrkB信號通路促進神經(jīng)細胞軸突再生。

原肌球蛋白相關(guān)激酶（tropomyosin related kinase，Trk）受體是酪氨酸激酶受體家族的一種，包括TrkA、TrkB和TrkC共3種亞型［16］。腦源性神經(jīng) 營 養(yǎng) 因 子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是小分子多肽，在神經(jīng)元的發(fā)育、受損神經(jīng)元的修復(fù)和軸突的再生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［17］。BDNF和受體TrkB結(jié)合后，會激活3個主要的信號傳導(dǎo)途徑：磷脂激3（PI3K）、磷脂酶Cγ（PLCγ）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）［18］。除此之外，BDNF也可以調(diào)節(jié)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），對神經(jīng)細胞具有保護作用［19］。PI3K/AKT信號通路有助于穩(wěn)定大腦內(nèi)環(huán)境和保護神經(jīng)元。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，通過PI3K/Akt信號通路逐級調(diào)節(jié)，促進3-磷脂酰肌醇依賴性的蛋白激酶-1（3-phos?phoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）磷酸化，進一步激活雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和糖原合成激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3），促進蛋白的合成和軸突再生［20］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ERK的激活通過影響軸突的運輸、局部蛋白的合成和基因的表達來調(diào)節(jié)軸突的再生和神經(jīng)元的存活。細胞培養(yǎng)和動物模型表明，ERK的信號傳導(dǎo)主要參與體外軸突的生長和體內(nèi)遠距離神經(jīng)再生［21］。BDNF和TrkB受體結(jié)合后，導(dǎo)致細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)（如PLCγ）磷酸化，進而激活Ras/MEK/MAPK途徑，促進細胞的增殖和分化［22］。

軸突再生的機制尚不清晰，可能涉及到多個神經(jīng)遞質(zhì)和細胞受體，但與TrkB的關(guān)系密切。Zheng等［23］發(fā)現(xiàn)補腎益穗配方可以通過調(diào)節(jié)BDNF-TrkB信號通路以及下游的PI3K/AKT信號通路促進軸突再生；使用小分子TrkB激動劑可以促進周圍神經(jīng)切斷后的軸突再生［24］以及靶向TrkB可以促進髓鞘的再生，進一步促進軸突再生［25］。TrkB的激動抗體在體內(nèi)體外模型中可以提高運動神經(jīng)元的存活率，用于治療運動神經(jīng)元的變性［26］，促進損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)，改善神經(jīng)細胞的功能。Fan等［27］基于TrkB受體信號通路在軸突發(fā)芽、樹突狀喬木的增殖、突觸可塑性和神經(jīng)元分化中起關(guān)鍵作用，使用TrkB的激動劑可以挽救神經(jīng)元的丟失，對海馬神經(jīng)元具有保護作用，可用于治療早期阿爾茲海默病。因此，細胞表面的受體TrkB是促進軸突再生藥物潛在的作用靶標［28］。此外，TrkB的完整性表達對于軸突再生至關(guān)重要，TrkB過表達可以促進神經(jīng)細胞軸突再生［29］。在本研究中，實驗結(jié)果證明了CBL可以使神經(jīng)細胞內(nèi)TrkB的磷酸化水平上調(diào)，促進神經(jīng)細胞軸突再生。這些研究都表明TrkB與軸突再生密切相關(guān)，靶向TrkB可以促進軸突再生。除了以上的信號通路，是否存在其他的信號通路調(diào)控軸突再生，這些信號通路中是否存在聯(lián)系，激活多個信號通路是否可以進一步提高神經(jīng)細胞軸突再生的能力，這些問題都不是很清楚。所以，軸突再生的具體機制還沒有被真正闡明，仍然存在一些局限。

CBL是復(fù)合物，成分較為復(fù)雜，含有多種氨基酸和小分子多肽。本研究只是證明了CBL可以促進神經(jīng)細胞軸突再生，無法確定其真正的有效成分。有研究表明，CBL中的有效成分為小分子多肽，發(fā)揮著神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用。因此，需要進一步確定CBL中與TrkB結(jié)合的多肽，確定CBL中促進神經(jīng)細胞軸突再生的有效成分，以明確CBL臨床發(fā)揮藥效的有效成分。