周紹琴，王樂樂，吳映梅，周 艷 *，袁丹丹

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，貴州 貴陽 550004）

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.）Link]又名北冬蟲夏草或北蟲草，是子囊菌門（Ascomycota）肉座菌目（Hypocreales）麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）的模式菌種[1]。研究表明，蛹蟲草富含蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等活性物質(zhì)[2-4]。其中，蟲草素、蟲草酸及蟲草多糖是蛹蟲草子實(shí)體的主要活性成分，蟲草素（cordycepin）即3'-脫氧腺苷，它是CUNNINGHAM等于1950年首次從蛹蟲草寄生的昆蟲中分離出的抗菌物質(zhì)[5-6]，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等功效；蟲草酸即甘露醇，對(duì)人體內(nèi)羥基自由基具有良好的清除作用，此外，還可降低顱內(nèi)壓和眼內(nèi)壓[7-9]；蟲草多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等生物活性作用[10-12]。由于蛹蟲草野生資源稀缺，因此，蛹蟲草的人工培養(yǎng)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

大量研究表明，培養(yǎng)基對(duì)子實(shí)體的產(chǎn)量有很大的影響，適宜的培養(yǎng)基有利于蟲草素等核苷類物質(zhì)、蟲草酸、蟲草多糖等主要活性物質(zhì)的合成，從而增加出草率，降低生產(chǎn)成本[13-16]。目前針對(duì)固體培養(yǎng)基選擇的研究結(jié)果不盡一致，其原因可能是所選蛹蟲草菌種、培養(yǎng)條件不同等造成的。張顯科等[17]研究發(fā)現(xiàn)大米是栽培蛹蟲草的最佳培養(yǎng)基。馮景剛等[18]研究發(fā)現(xiàn)以小麥培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體干重大，出草質(zhì)量好，優(yōu)于大米、玉米、小米等。劉桂君等[19]采用燕麥、小米、大麥、大米4種培養(yǎng)基質(zhì)固體培養(yǎng)蛹蟲草，研究出不同的培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)蛹蟲草中蟲草酸及核苷類物質(zhì)的合成具有顯著差異。目前對(duì)蛹蟲草子實(shí)體人工培養(yǎng)的固體基質(zhì)單一，且目標(biāo)產(chǎn)物多局限于提高子實(shí)體中的蟲草素，而對(duì)于其他活性物質(zhì)蟲草酸、蟲草多糖的研究鮮有報(bào)道。為提高蛹蟲草子實(shí)體中多種活性物質(zhì)，從而為目標(biāo)產(chǎn)物選擇實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)，本研究采用不同固體培養(yǎng)基對(duì)蛹蟲草進(jìn)行培養(yǎng)，觀察蛹蟲草子實(shí)體的生長(zhǎng)狀況、檢測(cè)主要活性物質(zhì)并測(cè)定抗氧化活性，以期為后續(xù)蛹蟲草發(fā)酵生產(chǎn)獲取不同目標(biāo)產(chǎn)物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料及菌種

大米、小米、麥麩、小麥、薏仁米（培養(yǎng)基質(zhì)）（均為食品級(jí)）：市售。

蛹蟲草菌（Cordyceps militaris）CM01：來源于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

蛋白胨（生化試劑）：北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；乙腈（分析純）：淄博研晟新材料有限公司；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）：上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.77%）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）標(biāo)準(zhǔn)品：美國MedChemExpress公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：青島日水生物技術(shù)有限公司。

種子液培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，葡萄糖4 g，MgSO40.2 g，KH2PO40.1 g，200 mL蒸餾水。121 ℃滅菌30 min。

營(yíng)養(yǎng)液：種子液培養(yǎng)基與蒸餾水按照1∶1配制。

固體培養(yǎng)基：①小米20 g；②大米20 g；③薏仁米20 g；④小麥20 g；⑤小米15 g+麥麩5 g；⑥小麥15 g+麥麩5 g；⑦大米15 g+麥麩5 g；⑧薏仁米15 g+麥麩5 g。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司；TGL27A高速離心機(jī)：上海高致精密儀器有限公司；YXQ-LS-75SII高壓滅菌鍋：廣州罡然機(jī)電設(shè)備有限公司；SW-CJ-1D無菌操作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；THZ-D菌種振蕩培養(yǎng)箱：蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及培養(yǎng)

從4 ℃冰箱中取出菌種斜面，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化2 h備用。待培養(yǎng)基冷卻之后進(jìn)行接種，25 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3 d。

1.3.2 子實(shí)體培養(yǎng)

配制干料培養(yǎng)基：根據(jù)固體培養(yǎng)基基質(zhì)配方，將原料放入培養(yǎng)瓶用水泡3 h，將水倒掉之后按照干料∶營(yíng)養(yǎng)液=1∶1.5（g∶mL）的配比加入營(yíng)養(yǎng)液，115 ℃滅菌45 min，冷卻后無菌操作，將200 μL種子液接種到滅好菌的培養(yǎng)基中，于25 ℃條件下培養(yǎng)40～50 d，即可收獲子實(shí)體。

1.3.3 測(cè)定方法

（1）蟲草素的測(cè)定[20]

采用高效液相色譜法測(cè)定蟲草素含量，其色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（5∶95，V/V）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取6.8 mg蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，加超純水定容，使蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為272 mg/L，過0.22 μm濾膜，然后再依次稀釋成0.531 25 mg/mL、1.062 5 mg/mL、2.125 mg/mL、4.25 mg/mL、8.5 mg/mL、17 mg/mL、34 mg/mL的系列蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液。在色譜條件下依次進(jìn)樣，以蟲草素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=121.83x-84.383，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。

樣品中蟲草素提?。菏斋@子實(shí)體，60 ℃烘干、粉碎。精確稱取0.2 g粉末于具塞試管當(dāng)中，加入10 mL無菌水搖勻，超聲提取（功率200 W）1 h并且每隔20 min搖勻一次，超聲提取結(jié)束后在4 500 r/min的條件下離心15 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取濾液得到待測(cè)液。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蟲草素含量。

（2）蟲草酸的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定蟲草酸含量。甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：根據(jù)馬麥艷等[21]的方法，稍作修改。甘露醇標(biāo)樣100 mg，加蒸餾水100 mL配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的甘露醇溶液，然后用蒸餾水分別稀釋成所需濃度。取相應(yīng)濃度甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL于不同試管中，加入1 mL 15 mmol/L高碘酸鈉溶液混勻，室溫條件下放置10 min，加2 mL 0.1%L-鼠李糖溶液混合后加4 mL新配制的Nash試劑，水浴加熱15 min顯色，冷卻，在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度值（OD412nm值），以甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，OD412nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制蟲草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程y=0.004 2x-0.008 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

樣品處理及甘露醇測(cè)定方法：分別準(zhǔn)確稱量蛹蟲草子座粉末1.0 g，各加入20 mL超純水沸水浴提取1 h，將提取液離心（5 000 r/min、8 min）取上清液補(bǔ)水至20 mL，保存樣品，待測(cè)。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蟲草酸含量。

（3）蟲草多糖的測(cè)定[22]

蛹蟲草多糖提取：稱取子實(shí)體粉末0.1 g于試管中，加入2 mL NaOH（1 mol/L）于70 ℃烘箱70 min，漏斗過濾，加入2～3 mL蒸餾水沖洗試管殘?jiān)?，定容?50 mL容量瓶中，待測(cè)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取干燥葡萄糖，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于試管中，再添加蒸溜水使其達(dá)到2 mL。吸取苯酚（6%）1 mL于試管中，再吸取5 mL濃硫酸，靜置10 min。于旋渦混合儀上混勻，靜置20 min，以蒸餾水為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度值，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，OD490nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程：y=8.424 3x-0.005，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

（4）抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基（DPPH·）清除率的測(cè)定[23]：準(zhǔn)確稱取2 mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容至50 mL。取DPPH自由基乙醇溶液4 mL加入經(jīng)處理的1 mL樣品中，室溫暗反應(yīng)30 min，以無水乙醇代替樣品為空白對(duì)照，測(cè)定其在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值。DPPH自由基清除率按照以下公式計(jì)算：

式中：A0為空白吸光度值；Ai為樣品吸光度值；A1為樣品溶液本底的吸光度值。

ABTS自由基（ABTS·）清除率的測(cè)定[24-25]：取7.4 mmol/L的ABTS原液與等量2.45 mmol/L過硫酸鉀混合、在黑暗中放置12～14 h，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度值。樣品經(jīng)過離心后取40 μL，加水稀釋至1 mL，加入6 mL ABTS工作液，混合均勻后在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)吸光度值，無水乙醇作為空白，ABTS+·清除率按照以下公式計(jì)算：

式中：A0為空白吸光度值；Ai為樣品吸光度值；A1為樣品溶液本底的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草生長(zhǎng)情況

菌絲在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)45 d，不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草的生長(zhǎng)情況如表1所示。由表1可知，蛹蟲草在不同固體培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，采用小米＋麥麩配方時(shí)，蛹蟲草出芽時(shí)間最快，為12 d；蛹蟲草子實(shí)體長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為（6.50±0.15）cm，子實(shí)體鮮質(zhì)量最重，為（8.58±0.07）g，子實(shí)體生長(zhǎng)密集，粗壯，色澤為橙黃色。

表1 不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草生長(zhǎng)情況Table 1 Growth of Cordyceps militaris cultured on different solid media

2.2 不同固體培養(yǎng)基對(duì)蛹蟲草蟲草素含量的影響

由圖1可知，不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草，其子實(shí)體中蟲草素含量不同。其中，小米＋麥麩培養(yǎng)基培養(yǎng)出的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素的含量最高，為（6.53±0.06）mg/g；小麥＋麥麩培養(yǎng)基次之，為（5.31±0.09）mg/g；大米培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草菌素含量最低，僅為（2.13±0.07）mg/g。除大米培養(yǎng)基外，其他配方培養(yǎng)基所培養(yǎng)的子實(shí)體蟲草素均高于劉紅等[26]所培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素含量（2.147 2 mg/g）。

圖1 不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體的蟲草素含量Fig.1 Cordycepin content in Cordyceps militaris fruit bodies cultured on different solid media

2.3 不同固體培養(yǎng)基對(duì)蛹蟲草蟲草酸含量的影響

由圖2可知，不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草，其子實(shí)體中蟲草酸含量不同。其中，小米＋麥麩培養(yǎng)基培養(yǎng)出的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草酸的含量最高，為（7.66±0.21）mg/g，小麥＋麥麩培養(yǎng)基次之，為（6.97±0.51）mg/g，大米培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草酸含量最低，僅為（2.66±0.14）mg/g。

圖2 不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體的蟲草酸含量Fig.2 Cordyceps acid content in Cordyceps militaris fruit bodies cultured on different solid media

2.4 不同固體培養(yǎng)基對(duì)蛹蟲草蟲草多糖含量的影響

由圖3可知，不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草，所收獲的子實(shí)體中蟲草多糖含量不同。其中，貴州特色雜糧薏仁米培養(yǎng)基所培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草多糖的含量最高，為（59.07±1.89）mg/g；小麥＋麥麩培養(yǎng)基次之，為（52.60±1.73）mg/g；小米培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中蟲草多糖含量最低，僅為（36.30±0.94）mg/g。

圖3 不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體的蟲草多糖含量Fig.3 Cordyceps polysaccharide content in Cordyceps militaris fruit bodies cultured on different solid media

2.5 蛹蟲草活性物質(zhì)、自由基清除率相關(guān)性分析

由圖4可知，8種不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率的范圍分別為25.77%～66.84%和22.82%～68.28%。其中，薏仁米＋麥麩培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體DPPH自由基消除率及ABTS自由基清除率均高于其他培養(yǎng)基，分別為（66.84±0.77）%和（68.28±0.28）%；小麥＋麥麩培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體DPPH自由基消除率及ABTS自由基清除率次之，為（56.11±1.11）%和（57.16±0.25）%；大米培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體DPPH自由基消除率及ABTS自由基清除率效果最弱，僅為（30.85±2.08）%和（33.62±1.47）%。

圖4 不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of Cordyceps militaris fruit bodies cultured on different solid media

表2 蛹蟲草活性物質(zhì)與自由基清除率的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of active substance and free radical scavenging rate of Cordyceps militaris

從表2可知，ABTS自由基清除和蟲草多糖呈顯著的正相關(guān)性（P=0.02，R=0.78），DPPH自由基清除和ABTS自由基清除呈顯著的正相關(guān)性（P=0.02，R=0.93），蟲草素和蟲草酸呈顯著的正相關(guān)性（P=0.00，R=0.96）。

3 結(jié)論

不同培養(yǎng)基質(zhì)（薏仁米、小米、小麥、大米等）對(duì)蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)情況、蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖及抗氧化活性均有影響。其中，小米+麥麩培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體的生長(zhǎng)情況較佳，出芽時(shí)間最快，為12 d，子實(shí)體最長(zhǎng)，為（6.50±0.15）cm，鮮質(zhì)量最重，為（8.58±0.07）g，其蟲草素和蟲草酸含量最高，分別為（6.53±0.06）mg/g和（7.66±0.21）mg/g；薏仁米培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體蟲草多糖含量最高，為（59.07±1.89）mg/g，薏仁米＋麥麩培養(yǎng)基抗氧化活性最強(qiáng)，DPPH自由基消除率和ABTS自由基清除率分別為（66.84±0.77）%、（68.28±0.26）%。

小米＋麥麩中蟲草酸和蟲草素等核苷類物質(zhì)含量最高，薏仁米中蟲草多糖含量高及抗氧化性強(qiáng)。因此，小米＋麥麩適當(dāng)?shù)膹?fù)配比例可用于人工培養(yǎng)高產(chǎn)蟲草素、蟲草酸的蛹蟲草子實(shí)體，薏仁米更適合適合培養(yǎng)高產(chǎn)多糖和抗氧化性強(qiáng)的蛹蟲草子實(shí)體。