王 燕，李德美 *，孫智文，王宗義

（1.北京農(nóng)學院 食品科學與工程學院，北京 102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）是一種用于釀造葡萄酒的紅葡萄品種，原產(chǎn)自法國波爾多（Bordeaux）地區(qū)，生長容易，適合多種不同氣候，在全世界都有廣泛種植，雖然幾乎有葡萄酒出產(chǎn)的地方都可以見到赤霞珠的身影，但是它在世界各地區(qū)的表現(xiàn)是有所差異的。赤霞珠葡萄在中國葡萄酒產(chǎn)區(qū)栽培范圍最廣[1]，主要產(chǎn)區(qū)包括山東半島、寧夏賀蘭山東麓、新疆、河北、云南、山西清徐、甘肅武威等[2]。葡萄酒的感官品質(zhì)主要包括色澤、香氣及口感，其中口感是葡萄酒感官品質(zhì)的重要方面，葡萄酒的基本味覺成分都是可溶于水或酒精水溶液中的非揮發(fā)物質(zhì)[3]，主要包括糖類、醇類、有機酸類和酚類物質(zhì)，而酚類物質(zhì)對紅葡萄酒感官的作用尤為重要[4]。發(fā)酵過程中酵母利用糖分發(fā)酵成酒精，同時產(chǎn)生大量的中間與最終產(chǎn)物（如甘油等），這些成分構(gòu)成了葡萄酒的甜味來源。葡萄酒中的酸類物質(zhì)主要包括來自果實的酒石酸、蘋果酸和檸檬酸以及蘋果酸-乳酸發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸。多酚在葡萄酒中產(chǎn)生澀感和/或苦味，葡萄酒中的多酚化合物主要來自葡萄果皮、籽和果梗[5]，橡木也會給葡萄酒增加一些單寧[6]。單寧具有澀感，分為水解單寧和縮合單寧[7]?？s合單寧屬于黃烷-3-醇類[8]，在葡萄酒中主要是由兒茶素類化合物通過C4～C6和C4～C8鍵形成的聚合物[9]。原花青素是原花色素（縮合單寧）中最主要的一類化合物，是葡萄酒中的主要多酚，原花青素二聚體B1和B2是葡萄中最豐富的。紅葡萄酒的苦味主要是由閾值濃度下黃烷-3-醇產(chǎn)生的，黃烷-3-醇類單體包括兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表棓兒茶素、棓兒茶素等，其中兒茶素雖然也呈澀感通常被認為貢獻更多的苦味[4]。葡萄酒中非揮發(fā)風味物質(zhì)種類繁多，并且不同風味物質(zhì)之間存在相互作用（中和效應、協(xié)同效應、拮抗效應）[10]，因此，紅葡萄酒的味感平衡表現(xiàn)為甜味與酸味、苦澀感的總和的平衡，即甜味?酸味＋苦味[11]。

酚類物質(zhì)對紅葡萄酒的收斂性具有重要作用[12]，研究表明，葡萄酒的干澀與兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素及原花青素B1、B2含量顯著正相關(guān)[13]。左俊偉[14]對不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒口感特征分析發(fā)現(xiàn)，酸味、澀味、苦澀味、豐厚度為各產(chǎn)區(qū)酒樣的主要特征口感物質(zhì)。非揮發(fā)風味物質(zhì)對葡萄酒風味特征的影響首先取決于品種[15]。其次，同一品種在不同的生態(tài)因素（溫度、光照、土壤和水）的互相作用下，其果實特性和葡萄酒品質(zhì)參數(shù)都會受到影響[16]。即使在同一產(chǎn)區(qū)，不同地塊葡萄園所產(chǎn)的葡萄酒其揮發(fā)性成分在種類和含量都表現(xiàn)為各自特有的品質(zhì)特性[17]。國內(nèi)外研究已經(jīng)證實同一釀酒葡萄品種在不同產(chǎn)區(qū)栽培，其果實品質(zhì)具有地域特征性。楊洋等[18]研究了三個不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄果實品質(zhì)的指標發(fā)現(xiàn)，新疆石河子、山東蓬萊和寧夏銀川果實的含糖量、可滴定酸含量、總酚和單寧含量以及揮發(fā)性香氣物質(zhì)的組成等果實品質(zhì)指標均存在顯著差異。馬磊[19]通過超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）分析葡萄酒中非揮發(fā)風味物質(zhì)，實現(xiàn)對葡萄酒樣品在產(chǎn)區(qū)和品種間的有效識別，證明了中國葡萄酒基于有機酸和酚類物質(zhì)的種類和含量具有良好產(chǎn)地和品種間的特征性。國外研究學者基于葡萄酒的風味成分對葡萄酒產(chǎn)區(qū)和品種特征性的研究已經(jīng)很廣泛，BOSELLI E 等[20]對意大利白葡萄酒指紋圖譜分析，表明了同一產(chǎn)區(qū)、不同品種其化學成分和感官特性完全不同。SOUFLEROS E H等[21]通過對白葡萄酒中游離氨基酸的含量實現(xiàn)了產(chǎn)地、品種和年份的判別分析。

本研究以中國寧夏賀蘭山東麓、河北懷來、新疆焉耆等三個產(chǎn)區(qū)出產(chǎn)的2016年份15款赤霞珠干紅葡萄酒為對象，選定的三個葡萄酒產(chǎn)區(qū)南北緯度上差異不大，但海陸熱力性差異突出，自東向西從濕熱的海洋氣候過渡到干旱半干旱的沙漠氣候[22]，采用光譜法、比色法和高效液相色譜法分析非揮發(fā)風味物質(zhì)（糖類、醇類、酸類及酚類等）含量，尋找葡萄酒中非揮發(fā)風味物質(zhì)與產(chǎn)區(qū)之間的聯(lián)系與差異，討論通過非揮發(fā)風味物質(zhì)區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒的可能性，以期對不同風土條件下葡萄酒的風格特征研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒樣

樣品取自中國三個葡萄酒產(chǎn)區(qū)（寧夏賀蘭山東麓、新疆焉耆、河北懷來）不同酒莊出產(chǎn)的2016年15款赤霞珠干紅葡萄酒，均采用傳統(tǒng)工藝釀造，酒樣信息詳見表1。

表1 酒樣信息Table 1 Information of wine samples

1.1.2 化學試劑

福林-酚（Folin-Ciocalteau）試劑盒、沒食子酸標準品（純度≥98%）、對二甲基氨基肉桂醛（4-dimethylamino-cinnamon-aldehyde，DMACA）試劑盒、兒茶素標準品（100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L）：西班牙Bio Systems S.A.公司；原花青素標準品（純度≥95%）：北京博奧拓達科技有限公司；兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，EcG）、表棓兒茶素（epigallocatechin，EgC）、棓兒茶素（gallocatechin，GC）、原花青素B1（procyanidin B1，PC B1）、原花青素B2（procyanidin B2，PC B2）（純度均≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；硫酸鐵銨、鹽酸、正丁醇、乙酸乙酯（均為分析純）：北京化工廠；甲醇、乙酸、乙腈（均為色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FOSS WineScanTM葡萄酒分析儀：丹麥福斯（中國）有限公司；Bio Systems S.A.Y350半自動分析儀：西班牙Bio Systems S.A.公司；UV-1780分光光度計、LC-20AD高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有SPDM20A紫外檢測器和LabSolutions色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）：島津（中國）有限公司；platisil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）：北京迪馬科技有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III循環(huán)水真空泵：上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣常規(guī)理化指標測定

酒精度、還原糖、總酸、pH、揮發(fā)酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸等采用FOSS WineScanTM葡萄酒分析儀檢測。

1.3.2 總酚和黃烷醇含量的測定

（1）總酚含量的測定[23-24]

用移液槍精確吸取沒食子酸標準品/酒樣12 μL于比色皿中，加入Folin-Ciocalteau試劑盒A液800 μL，室溫（16～25 ℃）反應2 min，然后加入B液800 μL混勻，室溫反應8 min，分別在波長750 nm條件下測定試劑空白、標準品和酒樣的吸光度值A(chǔ)。以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，得到回歸方程：y=0.000 7x+0.01，相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.99。按照標準曲線回歸方程計算樣品中總酚含量（以沒食子酸計）。

（2）黃烷醇含量的測定[25]

精確吸取標準品/酒樣24 μL于比色皿中，加入DMACA試劑盒中A液800 μL，混勻，室溫反應2 min，在波長620 nm條件下測吸光度值A(chǔ)1。然后在反應體系中加入B液800 μL（B1液和B2液現(xiàn)用現(xiàn)混），混勻，室溫反應5 min。在乙醇和酸性介質(zhì)的存在下，樣品中的黃烷醇類物質(zhì)與發(fā)色基團對二甲基氨基肉桂醛反應，形成有色復合物，在波長620 nm條件下測定試劑空白、標準品和酒樣的吸光度值A(chǔ)2。根據(jù)如下公式計算標準品/樣品吸光度值的增量：

A=（A2-0.49×A1）標品/樣品-（A2-0.49×A1）試劑空白

以兒茶素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制兒茶素標準曲線，回歸方程：y=0.000 9x+0.010 4，相關(guān)系數(shù)（R2）=0.999 4。按照標準曲線回歸方程計算樣品中黃烷醇含量（以兒茶素計）。

1.3.3 總原花青素含量的測定[26]

溶液配制：2%硫酸鐵銨溶液、鹽酸正丁醇溶液、2 mol/L鹽酸溶液、0.5 mg/mL原花青素標準品溶液。

原花青素標準曲線的制作：用刻度移液管分別精確吸取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL原花青素標準品溶液于25 mL比色管中，用體積分數(shù)為95%乙醇定容至3 mL，得到原花青素標準品質(zhì)量濃度梯度為0、0.017 mg/mL、0.033 mg/mL、0.050 mg/mL、0.067 mg/mL、0.083 mg/mL。然后分別加入0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液和6 mL鹽酸正丁醇溶液，蓋塞，搖勻。在95 ℃恒溫水浴中保持40 min，取出，浸入冷水中快速冷卻，溶液顯紅色（或黃色）。取出比色管，在波長546 nm條件下測定其吸光度值，以原花青素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制原花青素標準曲線，得到回歸方程：y=43.684x+0.664 7，相關(guān)系數(shù)（R2）=0.999 7。

樣品稀釋及測定：吸取樣品1～2 mL于25 mL容量瓶中，定容至刻度，取3 mL稀釋后樣品，按標準品溶液的測定步驟，測定酒樣的吸光度值，按照原花青素標準曲線回歸方程計算酒樣中總原花青素的含量。

1.3.4 黃烷-3-醇單體和原花青素B1、B2含量的測定[27]

酒樣前處理：采用乙酸乙酯液-液萃取法，取10 mL酒樣，用30 mL乙酸乙酯，萃取3次，收集有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（25 ℃）濃縮至干，用10 mL色譜級甲醇溶解，-18 ℃避光保存，待液相色譜分析。樣品測定前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。

液相色譜分析條件：采用platisil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），紫外檢測波長為280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流速1 mL/min。流動相A為水∶乙酸（98∶2，V/V），流動相B為乙腈，梯度洗脫程序：0～10 min，10%B；10～15 min，10%～20%B；15～26 min，20%～40%B；26～30 min，40%～100%B；30～35 min，100%～10%B；35～40 min，10%B。

酚類物質(zhì)單體標準曲線的繪制：精確稱取7種酚類物質(zhì)標準品5 mg，于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得到500 mg/L的混合標準品溶液，稀釋成不同濃度梯度，-18 ℃保存。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

通過IBM SPSS Statistics 22.0對酒樣理化指標進行單因素方差分析（anaylsis of variance，ANOVA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。實驗數(shù)據(jù)均平行測定3次，結(jié)果以平均值±標準差（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃烷-3-醇單體和原花青素B1、B2的含量的測定

對7種物質(zhì)混標進樣分析，標準品高效液相色譜圖見圖1。由圖1可知，7種物質(zhì)能得到有效分離且出峰時間穩(wěn)定。按照優(yōu)化好的色譜條件進樣分析，以峰面積（y）為縱坐標，物質(zhì)含量（x）為橫坐標，建立標準曲線，回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可知，各物質(zhì)的含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.99，各物質(zhì)的最低檢測限均低于0.20 mg/L，將同一標樣和樣品分別連續(xù)進樣6次，記錄其保留時間和峰面積，標準品和樣品保留時間的相對標準偏差均在1%以內(nèi)，峰面積的相對標準偏差均在4%以內(nèi)，表明色譜工作穩(wěn)定、重復性好。

圖1 7種酚類物質(zhì)標準品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 7 phenols standards

表2 各酚類物質(zhì)的標準曲線和保留時間Table 2 Standard curve and retention time of each phenols

根據(jù)上述色譜條件，對采集的酒樣進行測定，按照各酚類物質(zhì)的標準曲線回歸方程計算酒樣中各酚類物質(zhì)含量。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒非揮發(fā)風味物質(zhì)特征的比較

不同產(chǎn)區(qū)酒樣理化指標測定結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒樣品理化指標Table 3 Physical and chemical indexes of Cabernet Sauvignon dry red wine samples from different regions

由表3可知，不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒酒石酸、總酚、總原花青素、黃烷醇、原花青素B1、表棓兒茶素、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素沒食子酸酯含量存在顯著差異；新疆焉耆產(chǎn)區(qū)與寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)相比，酒石酸、總原花青素、黃烷醇、原花青素B1、表棓兒茶素、兒茶素、原花青素B2含量存在極顯著差異（P＜0.01），總酚和表兒茶素沒食子酸含量存在顯著差異（P＜0.05）；河北懷來產(chǎn)區(qū)與寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)相比，總酚、總原花青素、表棓兒茶素含量存在極顯著差異（P＜0.01），原花青素B2含量存在顯著差異（P＜0.05）。存在差異性的原因可能是因為三個產(chǎn)區(qū)的氣候、光照、降水量、土壤以及葡萄酒釀造和陳釀方式的不同。

2.3 赤霞珠干紅葡萄酒的非揮發(fā)風味物質(zhì)含量主成分分析和層次聚類分析

對供試酒樣非揮發(fā)風味物質(zhì)含量進行主成分分析，大量原始信息被降為前2個主成分，分別占總體方差貢獻率的33.66%和27.07%，占總成分的60%以上。各指標在前2個主成分上的載荷圖見圖2。由圖2可知，總酚、黃烷醇、總原花青素、表棓兒茶素、兒茶素、原花青素B1、原花青素B2、表兒茶素沒食子酸酯聚集在第1主成分的正向端，酒精度、還原糖、總酸、檸檬酸、蘋果酸聚集在第2主成分的正向端。第1主成分中包含的物質(zhì)都是與葡萄酒的苦澀感相關(guān)的酚類物質(zhì)，第2主成分中包含的物質(zhì)是與葡萄酒甜感和酸感相關(guān)的物質(zhì)，結(jié)果表明干紅葡萄酒中的酚類物質(zhì)是影響其風格和品質(zhì)的重要因素。

圖2 理化指標主成分分析的因子載荷圖Fig.2 Factors load diagram of physical and chemical indexes by principal component analysis

不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒層次聚類分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，新疆焉耆產(chǎn)區(qū)酒樣與其他產(chǎn)區(qū)酒樣可以明顯歸為兩類，結(jié)合表3，焉耆產(chǎn)區(qū)酒樣還原糖和總酸含量均高于另外兩個產(chǎn)區(qū)，可能因為焉耆產(chǎn)區(qū)氣候相對溫暖、日照強烈、干燥少雨，使釀酒葡萄酒積累濃郁的風味物質(zhì)。寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)與河北懷來產(chǎn)區(qū)酒樣也得到了很好的區(qū)分，結(jié)合表3，河北懷來產(chǎn)區(qū)酒樣各酚類物質(zhì)含量均高于寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)，也可能是因為產(chǎn)區(qū)風土條件的不同，河北懷來產(chǎn)區(qū)受到季風氣候的影響，四季分明，海拔高的地區(qū)氣候比較涼爽，而賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)屬于典型的大陸性半濕潤半干旱氣候，晝夜溫差大，空氣濕度小。相同產(chǎn)區(qū)酒樣聚類在一起，表明相同年份相同品種的酒樣，產(chǎn)區(qū)是影響其風味差異的重要因素，本研究中酒樣中非揮發(fā)性物質(zhì)的含量指標可以作為鑒別酒樣產(chǎn)區(qū)的依據(jù)。

圖3 不同產(chǎn)區(qū)干紅葡萄酒層次聚類分析結(jié)果Fig.3 Hierarchical cluster analysis results of dry red wines from different regions

3 結(jié)論

本實驗通過對中國三個葡萄酒產(chǎn)區(qū)出產(chǎn)的2016年份15款赤霞珠干紅葡萄酒中非揮發(fā)風味物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)，甜味指標（酒精度、還原糖）和酸味指標（總酸、pH、蘋果酸、乳酸、檸檬酸）在不同產(chǎn)區(qū)酒樣間差異不顯著（P＞0.05），但酒石酸含量存在顯著性差異（P＜0.05）；而不同產(chǎn)區(qū)酒樣的主要苦澀味指標（總酚、總原花青素、黃烷醇、兒茶素、表棓兒茶素、原花青素B1、原花青素B2）存在極顯著性差異（P＜0.01）。

對供試干紅葡萄酒樣非揮發(fā)風味物質(zhì)含量進行主成分分析顯示，原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、黃烷醇、總酸、還原糖、酒精度對呈味特征貢獻較大；經(jīng)聚類分析顯示，同年份赤霞珠干紅葡萄酒非揮發(fā)風味物質(zhì)的產(chǎn)區(qū)聚類結(jié)果與酒樣產(chǎn)區(qū)來源一致表明可以基于非揮發(fā)風味物質(zhì)實現(xiàn)對葡萄酒產(chǎn)區(qū)的判定。